degq调控fengycin合成机理研究
生防枯草芽孢杆菌能产生多类抑菌物质，研究这类物质的合成和调控机理是重要内容之一。本课题组前期研究发现，枯草芽孢杆菌模式菌株BS168的抑菌物质泛革素（fengycin）的合成受sfp和degQ 2个功能基因的调控。其中，sfp 编码的4-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶负责修饰fengycin合成酶，使其成为有活性的全酶，而deg Q的调控机理未知。在本研究中，我们利用突变了BS168菌株中的双组份系统degS/degU中的调节子degU，得到了BS168△degU突变体。该突变体中分别转入sfp和sfp+degQ，得到了菌株BS168△degU(sfp)和BS168△degU(sfp+degQ)。活菌和脂肽类提取物的抑菌活性检测结果表明，只有BS168(sfp+degQ)具有抑制油菜菌核病菌的活性，而BS168(sfp)、BS168△degU(sfp)和BS168△degU(sfp+degQ)则不具有该抑菌活性。质谱检测结果表明，只有BS168(sfp+degQ)能同时产生fengycin和surfactin，而BS168(sfp)、BS168△degU(sfp)和BS168△degU(sfp+degQ)都只能产生surfactin。进一步利用EMSA的研究表明，DegU蛋白能结合到fengycin的启动子部分。这说明degQ能通过双组份系统degS/degU调控fengycin的合成。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 3
1.2.1 BS168 degU基因突变菌株的构建3
1.2.2 BS168相关突变型菌株的脂肽类化合物的提取及质谱分析6
1.2.3 BS168相关突变型菌株的脂肽化合物粗提取物平板对峙实验7
1.2.4 利用EMSA实验检测DegU蛋白结合Fengycin启动子的实验7
2 结果与分析8
2.1 BS168△degU突变型菌株的验证结果8
2.2 相关菌株抑菌活性的检测9
2.3 脂肽类化合物粗提物的质谱分析10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.4 EMSA结果证明degU蛋白能结合到fengycin的启动子部位11
3 讨论 12
致谢12
参考文献13
degQ调控Fengycin合成机理研究
引言
芽孢杆菌属（Bacillus）中的某些种，例如枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）等等，是研究植物根围促生细菌（Plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR）的典型代表。这类有益细菌通过成功定殖到植物根际、体表或体内，与病原菌竞争生存空间和营养物质，而且可以分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，并且同时诱导植物产生系统抗性抵御病原菌入侵，从而起到防治植物病害的作用。由于芽孢杆菌属细菌既能产生丰富的抗菌物质，还能形成适应性和抗逆性强的芽孢，所以成为了最具防病潜力与应用价值的一类生防菌。目前，许多芽孢杆菌菌株都被开发成商品化的生防制剂，比如GB03和MBI600等。拜耳公司开发的两种芽孢杆菌类生物杀菌剂产品Kodiak?Concentrate和Yield Shield?Concentrate Biological Fungicides，对镰刀菌属（Fusarium spp.）和丝核菌属（Rhizoctonia spp.）等植物病原真菌具有良好的防治效果。
芽孢杆菌能通过非核糖体途径，利用非核糖体多酶复合体（nonribosomal peptide synthetases，NRPSs）合成多类具有生物活性的抗菌物质。这类多酶复合体由多个模块（modules）按照特定空间顺序排列而成，每一个模块负责将一个特定的底物整合到产物的骨架中。NRPSs需要4′磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（sfp基因编码）进行修饰之后，才具有全酶活性。该酶能够将辅酶A上的4′磷酸泛酰巯基乙胺转移到NRPSs中的肽酰载体蛋白（peptidyl carrier protein，PCP）保守的丝氨酸残基侧链羟基之上，从而使载体蛋白由无活性的脱辅基（apo）形式转变为活性全蛋白（holo）形式。肽酰载体蛋白负责NRPSs途径的底物固定，是合成脂肽化合物如surfactin、fengycin、bcillomycin D、bacillibactin等所必需的酶[1,2]。
枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168菌株是研究芽孢杆菌的模式菌株，全基因组序列于1997年完成测序。BS168菌株中含有两种NRPSs, 分别是srf和pps操纵子，分别负责合成表面活性素（surfactin）和泛革素（fengycin）。但由于该菌株的sfp基因突变，导致不能合成这两类物质。并且还有研究表明，BS168菌株产生fengycin还受另外一个基因deg Q的调控。在BS168菌株中，由于degQ基因的启动子部分发生突变，致使其不能成功转录。当恢复该菌株中的sfp和deg Q表型后，该菌能产生fengycin。前期研究也表明，将来自解淀粉芽孢杆菌FZB42中的sfp基因导入BS168，并且同时deg Q的启动子替换为强启动子P43，则能使该菌株产生抑制真菌物质fengycin，但是deg Q调控fengycin的机理未知。
Fengycin是由10个氨基酸组成的多肽和1个C1317β羟基脂肪酸链所构成，其中多肽上的第3 和第10位的氨基酸通过内酯键形成环状结构，并且根据环肽上氨基酸的不同分为fengycin A、fengycin B和fengycin C[3,4]。Fengycin合成酶的操纵子（pps operon）具有5个开放阅读框，编码Pps AE 5个蛋白，组成10个氨基酸活化模块。Fengycin具有很强的抑制真菌活性，它能够穿透磷脂双分子层，打破脂质层的有序性，加强细胞质膜的渗透性，从而破坏细胞，是一种有效的磷脂及生物膜合成抑制剂[5,6]。已有研究证明，枯草芽胞杆菌BAB1菌株所产生的Fengycin对番茄灰霉病菌表现较强的拮抗活性，造成灰霉病菌菌丝畸形、膨大，部分原生质体外渗。抑菌活性测定表明，fengycin在C06菌株抑制褐腐病菌( Monilinia fructicola)发挥主要作用。YanezMendizabal等研究发现，尽管CPA8 菌株可以产生fengycin、iturin A和surfactin等多种脂肽类抗生素，但不具备fengycin合成能力的突变子完全丧失了对M．fructicola的抑菌活性，该结果同样证明fengycin在抑菌活性中发挥主要的作用[7,8]。同时fengycin还可以作为激发子来诱导植物产生诱导性系统抗性(ISR)[9]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 3
1.2.1 BS168 degU基因突变菌株的构建3
1.2.2 BS168相关突变型菌株的脂肽类化合物的提取及质谱分析6
1.2.3 BS168相关突变型菌株的脂肽化合物粗提取物平板对峙实验7
1.2.4 利用EMSA实验检测DegU蛋白结合Fengycin启动子的实验7
2 结果与分析8
2.1 BS168△degU突变型菌株的验证结果8
2.2 相关菌株抑菌活性的检测9
2.3 脂肽类化合物粗提物的质谱分析10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.4 EMSA结果证明degU蛋白能结合到fengycin的启动子部位11
3 讨论 12
致谢12
参考文献13
degQ调控Fengycin合成机理研究
引言
芽孢杆菌属（Bacillus）中的某些种，例如枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）等等，是研究植物根围促生细菌（Plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR）的典型代表。这类有益细菌通过成功定殖到植物根际、体表或体内，与病原菌竞争生存空间和营养物质，而且可以分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，并且同时诱导植物产生系统抗性抵御病原菌入侵，从而起到防治植物病害的作用。由于芽孢杆菌属细菌既能产生丰富的抗菌物质，还能形成适应性和抗逆性强的芽孢，所以成为了最具防病潜力与应用价值的一类生防菌。目前，许多芽孢杆菌菌株都被开发成商品化的生防制剂，比如GB03和MBI600等。拜耳公司开发的两种芽孢杆菌类生物杀菌剂产品Kodiak?Concentrate和Yield Shield?Concentrate Biological Fungicides，对镰刀菌属（Fusarium spp.）和丝核菌属（Rhizoctonia spp.）等植物病原真菌具有良好的防治效果。
芽孢杆菌能通过非核糖体途径，利用非核糖体多酶复合体（nonribosomal peptide synthetases，NRPSs）合成多类具有生物活性的抗菌物质。这类多酶复合体由多个模块（modules）按照特定空间顺序排列而成，每一个模块负责将一个特定的底物整合到产物的骨架中。NRPSs需要4′磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（sfp基因编码）进行修饰之后，才具有全酶活性。该酶能够将辅酶A上的4′磷酸泛酰巯基乙胺转移到NRPSs中的肽酰载体蛋白（peptidyl carrier protein，PCP）保守的丝氨酸残基侧链羟基之上，从而使载体蛋白由无活性的脱辅基（apo）形式转变为活性全蛋白（holo）形式。肽酰载体蛋白负责NRPSs途径的底物固定，是合成脂肽化合物如surfactin、fengycin、bcillomycin D、bacillibactin等所必需的酶[1,2]。
枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168菌株是研究芽孢杆菌的模式菌株，全基因组序列于1997年完成测序。BS168菌株中含有两种NRPSs, 分别是srf和pps操纵子，分别负责合成表面活性素（surfactin）和泛革素（fengycin）。但由于该菌株的sfp基因突变，导致不能合成这两类物质。并且还有研究表明，BS168菌株产生fengycin还受另外一个基因deg Q的调控。在BS168菌株中，由于degQ基因的启动子部分发生突变，致使其不能成功转录。当恢复该菌株中的sfp和deg Q表型后，该菌能产生fengycin。前期研究也表明，将来自解淀粉芽孢杆菌FZB42中的sfp基因导入BS168，并且同时deg Q的启动子替换为强启动子P43，则能使该菌株产生抑制真菌物质fengycin，但是deg Q调控fengycin的机理未知。
Fengycin是由10个氨基酸组成的多肽和1个C1317β羟基脂肪酸链所构成，其中多肽上的第3 和第10位的氨基酸通过内酯键形成环状结构，并且根据环肽上氨基酸的不同分为fengycin A、fengycin B和fengycin C[3,4]。Fengycin合成酶的操纵子（pps operon）具有5个开放阅读框，编码Pps AE 5个蛋白，组成10个氨基酸活化模块。Fengycin具有很强的抑制真菌活性，它能够穿透磷脂双分子层，打破脂质层的有序性，加强细胞质膜的渗透性，从而破坏细胞，是一种有效的磷脂及生物膜合成抑制剂[5,6]。已有研究证明，枯草芽胞杆菌BAB1菌株所产生的Fengycin对番茄灰霉病菌表现较强的拮抗活性，造成灰霉病菌菌丝畸形、膨大，部分原生质体外渗。抑菌活性测定表明，fengycin在C06菌株抑制褐腐病菌( Monilinia fructicola)发挥主要作用。YanezMendizabal等研究发现，尽管CPA8 菌株可以产生fengycin、iturin A和surfactin等多种脂肽类抗生素，但不具备fengycin合成能力的突变子完全丧失了对M．fructicola的抑菌活性，该结果同样证明fengycin在抑菌活性中发挥主要的作用[7,8]。同时fengycin还可以作为激发子来诱导植物产生诱导性系统抗性(ISR)[9]。
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