二化螟painwtrw和nompc基因克隆及序列分析
瞬时感受器电位通道(transient receptor potential，TRP channels)是一类位于细胞膜上重要的阳离子通道。TRP通道家族基因广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，几乎参与了所有感觉的形成，例如触觉、嗅觉、听觉、本体感觉等。在果蝇中，目前已鉴定得到的13个果蝇TRP通道基因划分为TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPP、TRPN和TRPV7个亚家族。其中Pain（Painless）和Wtrw（Water witch）基因属于TRPA亚家族，在果蝇的高温感受和伤害性感受方面发挥着重要作用。NompC（No Mechanoreceptor Potential C）基因是TRPN亚家族唯一的成员，在果蝇的幼虫和成虫的运动协调方面起到重要作用。以果蝇的Pain，Wtrw和NompC基因序列为诱饵，通过NCBI（National Center of Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中二化螟基因组以及实验室中测得的转录组数据进行TBLASTN比对后，鉴定得到了编码二化螟的Pain，Wtrw，NompC基因片段。采用反转录 PCR （Reverse transcription PCR， RT-PCR）技术进行二化螟Pain，Wtrw，NompC基因克隆，得到Pain，Wtrw，NompC基因的cDNA片段，并在此基础上进行了序列分析和同源性比较。
目录
摘要 3
关键词 3
ABSTRACT 3
KEY WORDS 3
1材料与方法 4
1.1供试昆虫 4
1.2主要试剂和仪器 4
1.2.1主要试剂 4
1.2.2主要仪器 4
1.3试验方法 5
1.3.1二化螟总RNA的提取及CDNA的合成 5
1.3.2生物信息学分析及基因克隆 5
1.3.3基因序列分析 5
1.3.4同源基因聚类分析及进化树的构建 5
2结果与分析 6
2.1二化螟PAIN基因的克隆 6
2.2二化螟PAIN，WTRW和NOMPC基因的分类定位与 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
进化关系 7
2.3基因序列分析 7
3讨论 7
致谢 8
参考文献 9
图2 10
图2 12
图3 12
图4 14
二化螟Pain,Wtrw和NompC基因克隆及序列分析
引言
瞬时受体电位离子通道（transient receptor potential,TRP）可被多种作用机制激活，参与到昆虫的各种感觉形成过程中，例如视觉、嗅觉、温度感觉、机械感觉等。TRP通道家族中TRPA亚家族成员Pain（Painless）基因和Wtrw（Water witch）基因在C末端具有卷曲螺旋区域，其中Pain（Painless）基因在果蝇（Drosophila melanogaster）体内参与伤害性感受和高温感受方面发挥着重要作用[1]。检测湿度变化的能力对昆虫至关重要，研究表明果蝇Wtrw基因可以使果蝇非常敏感地检测环境湿度的变化[2]。NompC （No Mechanoreceptor Potential C）定位于味觉感觉器中的神经元的感觉树突，并且对于它们的机械诱发反应是至关重要的[3],并且是果蝇触觉和听觉的机械转导通道[4]。吡蚜酮是一作用机理特殊的新型杀虫剂，研究证明，昆虫TRP通道家族的TRPV亚家族中，Nanchung和Inactive蛋白所形成的复合物是其作用的分子靶标。TRP 通道超家族可分为 7 个亚家族， 分别命名为 TRPC （ Canonical）、TRPV（ Vanilloid）、 TRPA（ ANKTM1）、 TRPM（ Melastatin）、 TRPN（ NompC）、 TRPML（ Mucolipin）和 TRPP（ Polycystin）[5]。TRP通道家族基因广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，几乎参与了所有感觉的形成。但是在昆虫中对于该家族基因的研究仅局限于少数生物中，对于其在农业害虫中的研究较少。对二化螟（Chilo suppressalis） 的Pain基因进行克隆并对其蛋白序列进行分析，可以为下一步深入研究其在二化螟行为调控方面的功能提供依据。
1材料与方法
1.1供试昆虫
本实验所用的昆虫为二化螟，是20162017年采自江西南城的田间种群。供试种群参照韩兰芝等（2009）推荐的人工饲料配方进行室内饲养。饲养条件保持稳定：温度28℃±1℃,相对湿度70%±10 %，光周期16h：8h（L：D）。体重范围69mg的四龄中期幼虫为标准供试昆虫。
1.2主要试剂和仪器
1.2.1主要试剂
总RNA提取试剂（TRIzol Reagent）购自上海Invitrogen公司；
TaKaRa LA Taq with GC Buffer、pMD?19T Vector Cloning Kit均购自Takara宝生物工程（大连）有限公司；
MMLV反转录（BioTeke supermoⅢ RT Kit）购自北京百泰克（BioTeke）生物技术有限公司；
IPTG、Xgal和Ampicillin购自北京索莱宝（Solarbio）科技有限公司；
DH5α Competent Cell购自北京康为世纪（cwbiotech）生物科技有限公司；
凝胶回收试剂盒（E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit）购自美国OMEGA Biotek公司。
2×Taq Master Mix (Dye Plus)、Marker等购自南京诺唯赞（Vazyme）生物科技有限公司
1.2.2主要仪器
微量移液器
德国Eppendorf
凝胶成像系统（VersaDoc MP 4000）
美国BioRad
全自动样品快速研磨仪（Tissuelyser48）
上海净信科技
紫外分光光度计（Nanodrop 1000）
美国Thermo Fisher Scientific
AllegraTM 64R 离心机
美国Beckman
Master cycler Nexus PCR仪
德国Eppendorf
目录
摘要 3
关键词 3
ABSTRACT 3
KEY WORDS 3
1材料与方法 4
1.1供试昆虫 4
1.2主要试剂和仪器 4
1.2.1主要试剂 4
1.2.2主要仪器 4
1.3试验方法 5
1.3.1二化螟总RNA的提取及CDNA的合成 5
1.3.2生物信息学分析及基因克隆 5
1.3.3基因序列分析 5
1.3.4同源基因聚类分析及进化树的构建 5
2结果与分析 6
2.1二化螟PAIN基因的克隆 6
2.2二化螟PAIN，WTRW和NOMPC基因的分类定位与 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
进化关系 7
2.3基因序列分析 7
3讨论 7
致谢 8
参考文献 9
图2 10
图2 12
图3 12
图4 14
二化螟Pain,Wtrw和NompC基因克隆及序列分析
引言
瞬时受体电位离子通道（transient receptor potential,TRP）可被多种作用机制激活，参与到昆虫的各种感觉形成过程中，例如视觉、嗅觉、温度感觉、机械感觉等。TRP通道家族中TRPA亚家族成员Pain（Painless）基因和Wtrw（Water witch）基因在C末端具有卷曲螺旋区域，其中Pain（Painless）基因在果蝇（Drosophila melanogaster）体内参与伤害性感受和高温感受方面发挥着重要作用[1]。检测湿度变化的能力对昆虫至关重要，研究表明果蝇Wtrw基因可以使果蝇非常敏感地检测环境湿度的变化[2]。NompC （No Mechanoreceptor Potential C）定位于味觉感觉器中的神经元的感觉树突，并且对于它们的机械诱发反应是至关重要的[3],并且是果蝇触觉和听觉的机械转导通道[4]。吡蚜酮是一作用机理特殊的新型杀虫剂，研究证明，昆虫TRP通道家族的TRPV亚家族中，Nanchung和Inactive蛋白所形成的复合物是其作用的分子靶标。TRP 通道超家族可分为 7 个亚家族， 分别命名为 TRPC （ Canonical）、TRPV（ Vanilloid）、 TRPA（ ANKTM1）、 TRPM（ Melastatin）、 TRPN（ NompC）、 TRPML（ Mucolipin）和 TRPP（ Polycystin）[5]。TRP通道家族基因广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，几乎参与了所有感觉的形成。但是在昆虫中对于该家族基因的研究仅局限于少数生物中，对于其在农业害虫中的研究较少。对二化螟（Chilo suppressalis） 的Pain基因进行克隆并对其蛋白序列进行分析，可以为下一步深入研究其在二化螟行为调控方面的功能提供依据。
1材料与方法
1.1供试昆虫
本实验所用的昆虫为二化螟，是20162017年采自江西南城的田间种群。供试种群参照韩兰芝等（2009）推荐的人工饲料配方进行室内饲养。饲养条件保持稳定：温度28℃±1℃,相对湿度70%±10 %，光周期16h：8h（L：D）。体重范围69mg的四龄中期幼虫为标准供试昆虫。
1.2主要试剂和仪器
1.2.1主要试剂
总RNA提取试剂（TRIzol Reagent）购自上海Invitrogen公司；
TaKaRa LA Taq with GC Buffer、pMD?19T Vector Cloning Kit均购自Takara宝生物工程（大连）有限公司；
MMLV反转录（BioTeke supermoⅢ RT Kit）购自北京百泰克（BioTeke）生物技术有限公司；
IPTG、Xgal和Ampicillin购自北京索莱宝（Solarbio）科技有限公司；
DH5α Competent Cell购自北京康为世纪（cwbiotech）生物科技有限公司；
凝胶回收试剂盒（E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit）购自美国OMEGA Biotek公司。
2×Taq Master Mix (Dye Plus)、Marker等购自南京诺唯赞（Vazyme）生物科技有限公司
1.2.2主要仪器
微量移液器
德国Eppendorf
凝胶成像系统（VersaDoc MP 4000）
美国BioRad
全自动样品快速研磨仪（Tissuelyser48）
上海净信科技
紫外分光光度计（Nanodrop 1000）
美国Thermo Fisher Scientific
AllegraTM 64R 离心机
美国Beckman
Master cycler Nexus PCR仪
德国Eppendorf
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