棉花黄萎病抗性及其磷酸化蛋白质组学分析方法的研究
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌侵染引起的一种严重威胁棉花产量及纤维品质的病害。本实验以农杆菌转化法转化强致病力型大丽轮枝菌Vd991，获得了能稳定表达绿色荧光蛋白的转基因大丽轮枝菌菌株Vd991-GFP。以陆地棉TM-1为材料，采用培养基定量接种法分别接种野生型Vd991与转基因大丽轮枝菌Vd991-GFP，比较其致病力变化，及检测转基因大丽轮枝菌侵染棉苗后绿色荧光的移动情况。发现Vd991-GFP依然能导致明显的棉花黄萎病症状，且随着侵染时间的延长，维管束荧光缓慢上移，最后在病斑处观察到荧光，证明转基因大丽轮枝菌导致了黄萎病病症。采用苯酚-甲醇法法提取Vd991-GFP侵染1天后的TM-1棉根茎总蛋白，Trypsin酶切成为肽段。采用TiO2亲和色谱法富集磷酸化肽段，通过LC-MS/MS分析，检测到个110个肽段，其中有71个磷酸化肽段，占总肽段的64.55%，对应57个磷酸化蛋白质。初步建立了棉花磷酸化蛋白质分析技术，为进一步分析棉花黄萎病抗性分子机制奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1质粒与菌株4
1.1.2植物材料4
1.2方法 4
1.2.1 大丽轮枝菌Vd991的转化及验证 4
1.2.2转基因大丽轮枝菌侵染实验与致病性分析4
1.2.3棉花黄萎病抗性相关的磷酸肽富集与分析5
2 结果与分析6
2.1 转GFP大丽轮枝菌获得6
2.1.1 载体转化农杆菌结果验证6
2.1.2 大丽轮枝菌Vd991转化子的验证6
2.2 转基因大丽轮枝菌致病性分析7
2.2.1 转化子致病性鉴定7
2.2.2 GFP标记大丽轮枝菌侵染观察8
2.3 棉花黄萎病抗性相关的磷酸肽富集与分析8
3讨论 10
致谢11
参考文献11
棉花黄萎病抗性及其磷酸化蛋白质组学分析方法的研究
引言
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
棉花是世界主要经济作物之一，棉花纤维属于可再生的天然纤维，具有化学纤维不可比拟优异特征，主要用于纺织，深受人们的喜爱。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌和黑白轮枝菌引起的土传系统维管束病害，在我国病原菌主要是大丽轮枝菌。1935 年棉花黄萎病由引进美国斯字棉种传入中国并逐年传播扩散，20世纪90年代后该病已经蔓延到包括新疆在内的各个棉区,是棉花生产的制约病害之一。棉花黄萎病缺少有效的化学防治措施，选育抗病品种被认为是最经济有效的方法，但陆地棉遗传基础单一抗黄萎病资源缺乏，通过传统育种方法选育抗黄萎病品种的进展缓慢。随着现代基因工程技术进行抗病分子育种条件趋于成熟，更加深入理解植物抗黄萎病的机制，找到调控机制中的关键因子，为棉花抗病分子育种提供候选基因的意义重大(徐理 等 , 2012)。
目前美国已经公布了分离自美国加利福尼亚州莴苣上的大丽轮枝菌菌株VdLs.17 的基因组草图数据库。同时发布的还有黑白轮枝菌（Verticillium. alboatrum）的基因组数据，2013 年7 月更正为苜蓿轮枝菌（Verticillium. alfalfae）(林玲 等 , 2014)。尽管不同来源的大丽轮枝菌菌株基因组之间存在微小差异，仍为今后克隆更多的棉花黄萎病菌的致病相关基因、探究致病机理奠定了极其重要的基础。根据基因对基因假说，当携带无毒基因的病原与携带抗病基因的寄主互作时，二者才表现不亲和，即寄主表现抗病；其它情况下，二者表现亲和，即寄主感病。目前在番茄大丽轮枝菌生理小种1中发现1个50kb的基因片段，含1个无毒基因Ave1，与携带抗病基因Ve1的寄主互作时，寄主表现抗病性( Jonge R D. et al., 2012)。大丽轮枝菌基因组中还有许多编码分泌蛋白、以及各类代谢的酶类基因，这些基因与维管束细胞壁降解酶类基因相互作用，可以增强病原菌致病力，克服植物抗病性。这些研究平台和进展，为大丽轮枝菌侵染棉花的分子机制的研究提供了工具和参考。
近年来，棉花基因组研究也取得了巨大的进展，二倍体亚洲棉（A组）、雷蒙德氏（D组）以及四倍体陆地棉（AtDt）全基因组序列都先后由我国科学家完成了测序工作。Yujuan Zhang 等通过构建接种和未接种大丽轮枝菌的海岛棉品种海7124和陆地棉品种Yi11的小RNA文库，获得了198个miRNA，且大部分在库间存在差异，通过深度测序和降解组分析发现107个miRNA靶标基因，通过Gene Ontology分析，发现一些靶标基因与根的发育和植物抗性有关( Yujuan Z. et al., 2015)。Sun Quan 等利用RNAseq方法，发现大丽轮枝菌侵染与未侵染的海岛棉和陆地棉的转录组相比，有44个基因存在表达差异，包括HCT (Hydroxycinnamoyl transferase)，PAL（Phenylalanine ammonialyase），4CL（4coumarate），CAD（Cinnamyl alcohol dehydrogenase），CCoAOMT（CaffeoylCoA Omethyltransgerase） 和COMT（Caffeoyl Omethyltransgerase)等(Quan S. et al., 2013)。Weiping Fang 等通过iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantification)研究，棉花(G. thurberi)侵染大丽轮枝菌后，蛋白质水平的变化，在鉴定得到的6533个蛋白中有396个上调表达，279个下调表达，这些蛋白的主要功能包括，细胞壁组织加固，次级代谢的抗病物质，激素信号等( Weiping F. et al., 2015) 。Gao Xiquan 等通过病毒诱导的基因沉默研究发现，当沉默棉花中的基因GhMKK2、GhVe1、GhBAK1和GhNDR1时，棉花会失去对黄萎病菌抗性(Xiquan G. et al., 2013; Gao X. et al., 2011)。
Kawchuk等从番茄中采用图位克隆法得到Ve1和Ve2两个黄萎病抗性基因，它们位于同一基因座是两个紧密连锁的反向基因，均编码细胞表面的类受体激酶蛋白(Kawchuk L M. et al., 2001)。Ve蛋白在植物细胞内介导的信号传导可能类似于哺乳动物的细胞生成素受体，配体首先与二聚体化的RLPs蛋白结合并导致胞外和胞内的结构域变化，结合不同的信号因子而发生酪氨酸磷酸化作用，从而启动信号转导，而信号转导的途径和效率直接影响到抗病反应。(Fradin E F. et al., 2011)。其中一部分与MAPK信号通路连接，且研究者从海岛棉中克隆了与Ve1具有较高同源性的类受体蛋白基因，在拟南芥和陆地棉中过量表达该基因，其对落叶型和非落叶型黄萎病菌的抗性都有所提高。因此，蛋白质的磷酸化和脱磷酸化可能在棉花黄萎病抗性机制及信号通路中起到关键的作用。研究大丽轮枝菌侵染过程中棉花磷酸化蛋白质的动态变化，将有助于揭示大丽轮枝菌与棉花相互识别、信号传递以及防卫反应的启动等黄萎病抗性分子机制，鉴定棉花黄萎病抗性关键基因。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1质粒与菌株4
1.1.2植物材料4
1.2方法 4
1.2.1 大丽轮枝菌Vd991的转化及验证 4
1.2.2转基因大丽轮枝菌侵染实验与致病性分析4
1.2.3棉花黄萎病抗性相关的磷酸肽富集与分析5
2 结果与分析6
2.1 转GFP大丽轮枝菌获得6
2.1.1 载体转化农杆菌结果验证6
2.1.2 大丽轮枝菌Vd991转化子的验证6
2.2 转基因大丽轮枝菌致病性分析7
2.2.1 转化子致病性鉴定7
2.2.2 GFP标记大丽轮枝菌侵染观察8
2.3 棉花黄萎病抗性相关的磷酸肽富集与分析8
3讨论 10
致谢11
参考文献11
棉花黄萎病抗性及其磷酸化蛋白质组学分析方法的研究
引言
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
棉花是世界主要经济作物之一，棉花纤维属于可再生的天然纤维，具有化学纤维不可比拟优异特征，主要用于纺织，深受人们的喜爱。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌和黑白轮枝菌引起的土传系统维管束病害，在我国病原菌主要是大丽轮枝菌。1935 年棉花黄萎病由引进美国斯字棉种传入中国并逐年传播扩散，20世纪90年代后该病已经蔓延到包括新疆在内的各个棉区,是棉花生产的制约病害之一。棉花黄萎病缺少有效的化学防治措施，选育抗病品种被认为是最经济有效的方法，但陆地棉遗传基础单一抗黄萎病资源缺乏，通过传统育种方法选育抗黄萎病品种的进展缓慢。随着现代基因工程技术进行抗病分子育种条件趋于成熟，更加深入理解植物抗黄萎病的机制，找到调控机制中的关键因子，为棉花抗病分子育种提供候选基因的意义重大(徐理 等 , 2012)。
目前美国已经公布了分离自美国加利福尼亚州莴苣上的大丽轮枝菌菌株VdLs.17 的基因组草图数据库。同时发布的还有黑白轮枝菌（Verticillium. alboatrum）的基因组数据，2013 年7 月更正为苜蓿轮枝菌（Verticillium. alfalfae）(林玲 等 , 2014)。尽管不同来源的大丽轮枝菌菌株基因组之间存在微小差异，仍为今后克隆更多的棉花黄萎病菌的致病相关基因、探究致病机理奠定了极其重要的基础。根据基因对基因假说，当携带无毒基因的病原与携带抗病基因的寄主互作时，二者才表现不亲和，即寄主表现抗病；其它情况下，二者表现亲和，即寄主感病。目前在番茄大丽轮枝菌生理小种1中发现1个50kb的基因片段，含1个无毒基因Ave1，与携带抗病基因Ve1的寄主互作时，寄主表现抗病性( Jonge R D. et al., 2012)。大丽轮枝菌基因组中还有许多编码分泌蛋白、以及各类代谢的酶类基因，这些基因与维管束细胞壁降解酶类基因相互作用，可以增强病原菌致病力，克服植物抗病性。这些研究平台和进展，为大丽轮枝菌侵染棉花的分子机制的研究提供了工具和参考。
近年来，棉花基因组研究也取得了巨大的进展，二倍体亚洲棉（A组）、雷蒙德氏（D组）以及四倍体陆地棉（AtDt）全基因组序列都先后由我国科学家完成了测序工作。Yujuan Zhang 等通过构建接种和未接种大丽轮枝菌的海岛棉品种海7124和陆地棉品种Yi11的小RNA文库，获得了198个miRNA，且大部分在库间存在差异，通过深度测序和降解组分析发现107个miRNA靶标基因，通过Gene Ontology分析，发现一些靶标基因与根的发育和植物抗性有关( Yujuan Z. et al., 2015)。Sun Quan 等利用RNAseq方法，发现大丽轮枝菌侵染与未侵染的海岛棉和陆地棉的转录组相比，有44个基因存在表达差异，包括HCT (Hydroxycinnamoyl transferase)，PAL（Phenylalanine ammonialyase），4CL（4coumarate），CAD（Cinnamyl alcohol dehydrogenase），CCoAOMT（CaffeoylCoA Omethyltransgerase） 和COMT（Caffeoyl Omethyltransgerase)等(Quan S. et al., 2013)。Weiping Fang 等通过iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantification)研究，棉花(G. thurberi)侵染大丽轮枝菌后，蛋白质水平的变化，在鉴定得到的6533个蛋白中有396个上调表达，279个下调表达，这些蛋白的主要功能包括，细胞壁组织加固，次级代谢的抗病物质，激素信号等( Weiping F. et al., 2015) 。Gao Xiquan 等通过病毒诱导的基因沉默研究发现，当沉默棉花中的基因GhMKK2、GhVe1、GhBAK1和GhNDR1时，棉花会失去对黄萎病菌抗性(Xiquan G. et al., 2013; Gao X. et al., 2011)。
Kawchuk等从番茄中采用图位克隆法得到Ve1和Ve2两个黄萎病抗性基因，它们位于同一基因座是两个紧密连锁的反向基因，均编码细胞表面的类受体激酶蛋白(Kawchuk L M. et al., 2001)。Ve蛋白在植物细胞内介导的信号传导可能类似于哺乳动物的细胞生成素受体，配体首先与二聚体化的RLPs蛋白结合并导致胞外和胞内的结构域变化，结合不同的信号因子而发生酪氨酸磷酸化作用，从而启动信号转导，而信号转导的途径和效率直接影响到抗病反应。(Fradin E F. et al., 2011)。其中一部分与MAPK信号通路连接，且研究者从海岛棉中克隆了与Ve1具有较高同源性的类受体蛋白基因，在拟南芥和陆地棉中过量表达该基因，其对落叶型和非落叶型黄萎病菌的抗性都有所提高。因此，蛋白质的磷酸化和脱磷酸化可能在棉花黄萎病抗性机制及信号通路中起到关键的作用。研究大丽轮枝菌侵染过程中棉花磷酸化蛋白质的动态变化，将有助于揭示大丽轮枝菌与棉花相互识别、信号传递以及防卫反应的启动等黄萎病抗性分子机制，鉴定棉花黄萎病抗性关键基因。
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