大豆突变体子叶折叠性状的初步定位
大豆（Glycine max（L.）Merr）是重要的粮食和经济作物。子叶是种子胚的组成部分之—，大豆子叶的作用主要是在植株营养生长阶段供给幼苗养分；另外子叶还能提高幼苗对病虫害以及各种不良环境的抗性，从而影响大豆产量。因此，定位和克隆与大豆子叶发育相关的基因，并研究其功能，对提高大豆产量和品质有重要的意义。本研究以大豆子叶折叠突变体为实验材料，构建了突变体与大豆科丰1号品种的杂交群体，在F2代分离群体表型鉴定的基础上，利用群体分离分析法BSA（Bulked Segregant Analysis）及分子标记辅助选择MAS（Marker-assisted selection）的定位方法，进行基因连锁筛选和染色体定位。结果表明大豆子叶折叠突变体由2-3对隐性核基因控制，其中一个主效基因位于A1连锁群（5号染色体）Satt684标记附近。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1实验材料与地点3
1.2表型鉴定与遗传分析3
1.2.1突变体表型鉴定3
1.2.2遗传分析4
1.3实验方法及分子标记分析4
1.3.1DNA提取方法4
1.3.2突变体基因定位5
2结果与分析6
2.1杂交群体构建6
2.2表型鉴定6
2.3遗传分析7
2.4子叶折叠突变体的初步定位7
2.4.1筛选有多态的分子标记7
2.4.2突变体基因的初定位7
3结论与讨论9
致谢9
参考文献9
大豆突变体子叶折叠性状的初步定位
引言
引言
大豆，为豆科，属一年生草本植物，是原产于我国的世界性重要粮食、油料及经济作物，也是人类植物蛋白和食用油的主要来源[1]。大豆油的产量约占世界食用油的28％。大豆是世界上最重要的经济作物之一。由于大豆基因组结构复杂、遗传转化效率低等原因限制了其功能基因组研究的发展。但随着大豆基因组测序的完成,大豆功能基因组研究将成为研究的重点。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
大豆的子叶是大豆的重要器官，由受精卵分化发育而来，是胚的一部分，也是大豆贮藏营养或幼苗时期进行同化作用的器官。在无胚乳的种子内，子叶特别肥厚，贮藏着大量的营养物质；在有胚乳的种子内，子叶不发达，但它可从胚乳中吸收养料，供胚发育需要。另外子叶还能提高幼苗对病虫害以及各种不良环境的抵抗能力。因此，子叶的发育情况能够影响到大豆产量。
目前，在不同作物上已经报道了一些与子叶发育相关的研究。在黄瓜子叶的研究方面，王慧哲等[2]人以黄色子叶突变体B180H为母本,颜色正常子叶黄瓜Q12为父本,构建F1、F2、BC1群体,通过观察和遗传分析6世代子叶叶色表型,最后发现，黄瓜黄色子叶性状是通过1对核基因来调控的,其中绿色子叶相对比黄色子叶是完全显性。而在水果猕猴桃研究上，周艳玲等[3]人通过对"和平一号"美味猕猴桃辐射诱变从而获得三子叶突变体植株,通过对猕猴桃三子叶植株的一些形态特征如单叶长、单叶宽以及叶片气孔分布和表面毛状体等进行观察分析，发现三子叶植株叶表面的毛状体相对于双子叶猕猴桃植株表现出更加浓密,这些结果为进一步深入研究三子叶猕猴桃育种利用立下基础。子叶在油菜突变体的研究中，魏慧敏等[4]人以发育10 天的黄化油菜突变体为材料，测量了突变体油菜子叶类囊体膜的色素含量、室温吸收光谱、叶绿素荧光发射和激发光谱以及蛋白内源荧光光谱的数据和分析变化。通过分析发现突变体油菜子叶类囊体膜的蛋白内源荧光明显的不同于野生型,结果表明突变体油菜子叶类囊体膜蛋白组成可能发生改变。在大豆子叶互生突变的研究中，丁德荣等[5]人将大豆品种N8855种子浸种，之后播种在消毒土的盆钵里面，放置在无光照的生长箱，设定生长温度为29℃，生长第8天发现了其中株突变体(M0)子叶表现出互生现象，其余植株子叶都表现对生现象。此株子叶互生突变体(M0)的M1株系放在光照培养箱中生长，和N8855一样表现出子叶对生现象；其中通过暗室诱导子叶表现出互生现象，而植株的其余性状和N8855一致。其中M2代表现和M1一样。这种经暗室处理诱导表现子叶互生现象的实验在双子叶植物上是首例报道。
大豆子叶折叠突变体是由韩锁义博士2002年[6]通过NaN360Coγ诱变大豆栽培品种“南农9416”而得，其典型特征是子叶向外翻折。石蜡切片观察突变体早期胚胎形状，发现突变体的胚发育进程要明显晚于野生型，说明子叶折叠表型从胚胎早期就已经形成。品质测定结果表明：突变体种子的蛋白质和游离氨基酸的含量明显高于野生型，这说明子叶折叠基因可能与其品质性状相关联。
尽管通过对子叶折叠突变体的农艺及品质性状调查，发掘其具有很多应用价值，但是突变体内在的遗传机制还尚不清楚。因此，本研究通过构建杂交群体，利用图位克隆方法定位[7]控制子叶折叠的基因。这项研究的进行为日后应用突变体品质性状奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料和地点
本研究所用的材料是大豆子叶折叠突变体curledcotyledon (简称cco)，由韩锁义博士2002年通过NaN360Coγ诱变大豆栽培品种“南农9416”获得。该研究利用的定位群体是由cco与大豆“科丰1号”品种杂交而得。杂交群体的构建和F2代植株的种植均在大学江浦试验田完成。
1.2 表型鉴定和遗传分析
1.2.1 突变体表型鉴定
通过种子形态和出苗后子叶表型综合鉴定。由于大豆子叶折叠突变体会在种子表面上留有子叶折叠后的折痕，所以可首先通过肉眼筛选种皮上面有折痕的种子（包括种子双面折痕与单面折痕），然后再鉴定这些带有折痕种子出苗后子叶的表型是否与突变体一致，保留子叶折叠的单株（包括双折和单折），剔除子叶表型不一致或者畸形的单株。
1.2.2 遗传分析
为了研究子叶折叠突变体的遗传规律，在大学江浦试验田分别以子叶折叠突变体为父母本，与大豆科丰1号品种构建正反交组合。在苗期对杂交组合的正反交F1以及自交后代F2群体的子叶表型分离比进行统计分析； F1代的表型观察是确定基因的显隐性，F2代分离群体的表型比例统计是确定控制子叶折叠突变的基因对数。F2代分离群体的表型比例利用χ2测验法（卡方测验法)[8]进行遗传适合性分析，其中χ2测验法公式是：χ2=[|Ara|(r+1)/2]2/rn，其中A，a分别表示显性组合隐形组的实际观察数目，n=A+a,r代表显性组的分离比即（r:1）。
1.3实验方法及分子标记分析
1.3.1 DNA提取方法（采用CTAB法）[9]
1）取嫩叶片，液氮充分研磨成粉状，至2ml离心管。
2）在恒温水浴锅中65℃预热2×CTAB（表1）提取液30min，冰冻异丙醇5h。
3）加600μl 2×CTAB和20μlβ巯基乙醇，充分混匀，65℃水浴50min左右，期间每隔10min轻轻上下颠倒几次。
4）加入600μl氯仿：异戊醇（24:1）反复缓慢翻转轻轻摇10min，放入离心机，10,000 rpm 25℃，离心10min。
5）轻轻取出，用消毒且剪过的枪头缓慢吸取上清液500μl放人离心管中，加入600μl氯仿：异戊醇（24:1）反复缓慢翻转轻轻摇10min，再次4℃，10,000rmp，离心10min。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1实验材料与地点3
1.2表型鉴定与遗传分析3
1.2.1突变体表型鉴定3
1.2.2遗传分析4
1.3实验方法及分子标记分析4
1.3.1DNA提取方法4
1.3.2突变体基因定位5
2结果与分析6
2.1杂交群体构建6
2.2表型鉴定6
2.3遗传分析7
2.4子叶折叠突变体的初步定位7
2.4.1筛选有多态的分子标记7
2.4.2突变体基因的初定位7
3结论与讨论9
致谢9
参考文献9
大豆突变体子叶折叠性状的初步定位
引言
引言
大豆，为豆科，属一年生草本植物，是原产于我国的世界性重要粮食、油料及经济作物，也是人类植物蛋白和食用油的主要来源[1]。大豆油的产量约占世界食用油的28％。大豆是世界上最重要的经济作物之一。由于大豆基因组结构复杂、遗传转化效率低等原因限制了其功能基因组研究的发展。但随着大豆基因组测序的完成,大豆功能基因组研究将成为研究的重点。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
大豆的子叶是大豆的重要器官，由受精卵分化发育而来，是胚的一部分，也是大豆贮藏营养或幼苗时期进行同化作用的器官。在无胚乳的种子内，子叶特别肥厚，贮藏着大量的营养物质；在有胚乳的种子内，子叶不发达，但它可从胚乳中吸收养料，供胚发育需要。另外子叶还能提高幼苗对病虫害以及各种不良环境的抵抗能力。因此，子叶的发育情况能够影响到大豆产量。
目前，在不同作物上已经报道了一些与子叶发育相关的研究。在黄瓜子叶的研究方面，王慧哲等[2]人以黄色子叶突变体B180H为母本,颜色正常子叶黄瓜Q12为父本,构建F1、F2、BC1群体,通过观察和遗传分析6世代子叶叶色表型,最后发现，黄瓜黄色子叶性状是通过1对核基因来调控的,其中绿色子叶相对比黄色子叶是完全显性。而在水果猕猴桃研究上，周艳玲等[3]人通过对"和平一号"美味猕猴桃辐射诱变从而获得三子叶突变体植株,通过对猕猴桃三子叶植株的一些形态特征如单叶长、单叶宽以及叶片气孔分布和表面毛状体等进行观察分析，发现三子叶植株叶表面的毛状体相对于双子叶猕猴桃植株表现出更加浓密,这些结果为进一步深入研究三子叶猕猴桃育种利用立下基础。子叶在油菜突变体的研究中，魏慧敏等[4]人以发育10 天的黄化油菜突变体为材料，测量了突变体油菜子叶类囊体膜的色素含量、室温吸收光谱、叶绿素荧光发射和激发光谱以及蛋白内源荧光光谱的数据和分析变化。通过分析发现突变体油菜子叶类囊体膜的蛋白内源荧光明显的不同于野生型,结果表明突变体油菜子叶类囊体膜蛋白组成可能发生改变。在大豆子叶互生突变的研究中，丁德荣等[5]人将大豆品种N8855种子浸种，之后播种在消毒土的盆钵里面，放置在无光照的生长箱，设定生长温度为29℃，生长第8天发现了其中株突变体(M0)子叶表现出互生现象，其余植株子叶都表现对生现象。此株子叶互生突变体(M0)的M1株系放在光照培养箱中生长，和N8855一样表现出子叶对生现象；其中通过暗室诱导子叶表现出互生现象，而植株的其余性状和N8855一致。其中M2代表现和M1一样。这种经暗室处理诱导表现子叶互生现象的实验在双子叶植物上是首例报道。
大豆子叶折叠突变体是由韩锁义博士2002年[6]通过NaN360Coγ诱变大豆栽培品种“南农9416”而得，其典型特征是子叶向外翻折。石蜡切片观察突变体早期胚胎形状，发现突变体的胚发育进程要明显晚于野生型，说明子叶折叠表型从胚胎早期就已经形成。品质测定结果表明：突变体种子的蛋白质和游离氨基酸的含量明显高于野生型，这说明子叶折叠基因可能与其品质性状相关联。
尽管通过对子叶折叠突变体的农艺及品质性状调查，发掘其具有很多应用价值，但是突变体内在的遗传机制还尚不清楚。因此，本研究通过构建杂交群体，利用图位克隆方法定位[7]控制子叶折叠的基因。这项研究的进行为日后应用突变体品质性状奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料和地点
本研究所用的材料是大豆子叶折叠突变体curledcotyledon (简称cco)，由韩锁义博士2002年通过NaN360Coγ诱变大豆栽培品种“南农9416”获得。该研究利用的定位群体是由cco与大豆“科丰1号”品种杂交而得。杂交群体的构建和F2代植株的种植均在大学江浦试验田完成。
1.2 表型鉴定和遗传分析
1.2.1 突变体表型鉴定
通过种子形态和出苗后子叶表型综合鉴定。由于大豆子叶折叠突变体会在种子表面上留有子叶折叠后的折痕，所以可首先通过肉眼筛选种皮上面有折痕的种子（包括种子双面折痕与单面折痕），然后再鉴定这些带有折痕种子出苗后子叶的表型是否与突变体一致，保留子叶折叠的单株（包括双折和单折），剔除子叶表型不一致或者畸形的单株。
1.2.2 遗传分析
为了研究子叶折叠突变体的遗传规律，在大学江浦试验田分别以子叶折叠突变体为父母本，与大豆科丰1号品种构建正反交组合。在苗期对杂交组合的正反交F1以及自交后代F2群体的子叶表型分离比进行统计分析； F1代的表型观察是确定基因的显隐性，F2代分离群体的表型比例统计是确定控制子叶折叠突变的基因对数。F2代分离群体的表型比例利用χ2测验法（卡方测验法)[8]进行遗传适合性分析，其中χ2测验法公式是：χ2=[|Ara|(r+1)/2]2/rn，其中A，a分别表示显性组合隐形组的实际观察数目，n=A+a,r代表显性组的分离比即（r:1）。
1.3实验方法及分子标记分析
1.3.1 DNA提取方法（采用CTAB法）[9]
1）取嫩叶片，液氮充分研磨成粉状，至2ml离心管。
2）在恒温水浴锅中65℃预热2×CTAB（表1）提取液30min，冰冻异丙醇5h。
3）加600μl 2×CTAB和20μlβ巯基乙醇，充分混匀，65℃水浴50min左右，期间每隔10min轻轻上下颠倒几次。
4）加入600μl氯仿：异戊醇（24:1）反复缓慢翻转轻轻摇10min，放入离心机，10,000 rpm 25℃，离心10min。
5）轻轻取出，用消毒且剪过的枪头缓慢吸取上清液500μl放人离心管中，加入600μl氯仿：异戊醇（24:1）反复缓慢翻转轻轻摇10min，再次4℃，10,000rmp，离心10min。
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