大豆疫霉rxlr效应分子avh262稳定沉默转化子的筛选和致病性分析
摘要：大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一。研究大豆疫霉侵染大豆过程中效应分子的作用机制对于进一步揭示在与寄主互作过程中的病原菌的侵染非常重要。大豆疫霉基因组编码将近400个RxLR效应分子，本课题综合前期对大豆疫霉效应分子Avh262的研究结果，Avh262在大豆疫霉侵染寄主的初期上调表达，属于侵染初期显著上调表达的效应分子，并且能够能够促进疫霉的侵染，抑制植物的免疫反应。为了确定在侵染寄主大豆时Avh262对大豆疫霉毒性的贡献，利用PEG介导的基因沉默技术将大豆疫霉中的Avh262基因进行沉默，得到7个大豆疫霉Avh262稳定沉默转化子。然后接种大豆下胚轴进行致病力测定，结果表明，大豆疫霉Avh262沉默转化子完全丧失致病性，Avh262是大豆疫霉毒性必需的效应分子。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1供试大豆疫霉菌株和植物的培养2
1.2大豆疫霉游动孢子接种黄豆苗 2
1.2.1游动孢子的诱导2
1.2.2游动孢子接种黄豆苗2
1.3 RTPCR分析Avh262在大豆疫霉生活史阶段的表达 3
1.3.1 RNA的提取及反转录 3
1.3.2逆转录合成sscDNA4
1.4大豆疫霉Avh262效应分子序列多态性分析4
1.4.1数据获取 4
1.4.2大豆疫霉基因组的提取 4
1.4.3 验证大豆疫霉效应分子序列可靠性 5
1.4.4 多态性分析 5
1.5大豆疫霉Avh262基因的沉默 5
1.5.1 沉默转化载体的构建 5
1.5.2大豆疫霉PEG介导的原生质体转化 5
1.6 稳定沉默转化子的筛选 7
1.7稳定沉默转化子的致病力分析 7
2结果与分析 7
2.1 Avh262在大豆疫霉生活史阶段的基因表达 7
2.2 Avh262在大豆疫霉侵染寄主过程中的毒性贡
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
献 8
3讨论 9
致谢9
参考文献10
大豆疫霉RxLR效应分子Avh262
稳定沉默转化子的筛选和致病性分析
引言
大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一，每年导致全球十几亿美元的直接经济损失[1]。研究大豆疫霉侵染大豆过程中效应分子的作用机制对于进一步揭示在与寄主互作过程中的病原菌的侵染机制非常重要。
植物病原卵菌在与寄主植物互作的过程中，会分泌效应分子（effectors）[2]进入寄主细胞中，通过破坏或者干扰细胞代谢途径，在植物细胞内发挥毒性功能、抑制植物的免疫反应、帮助病原菌的侵染。通过生物信息学的比对以及卵菌基因组测序的不断发展，在疫霉的基因组中发现了一类大量存在的效应分子，这一类效应分子的共同特点是在N端都含有一个信号肽，后面紧随着一个保守的RxLRdEER motif[34]，我们称其为RxLR效应分子。最近发现效应分子的RxLR功能域可以与寄主细胞膜上的P13P结合，帮助效应分子进入寄主细胞内[5]。
本实验室之前对大豆疫霉RxLR效应分子的功能进行大规模的筛选，发现大多效应分子都能够抑制植物的细胞死亡，也有部分效应分子可以直接诱导植物免疫反应。在侵染初期显著上调表达的效应分子主要作用是抑制植物对病原菌识别产生的PTI(PAMPtriggered immunity) [6] ，是一种普遍存在但强度较弱的抗性, 可以抵抗多数病原菌的侵染；组成型高表达的效应分子则与抑制ETI(Effectortriggered immunity)有关，寄主又通过NBSLRR类抗病蛋白识别效应分子产生新的免疫反应ETI；病原菌则通过效应分子的变异逃避识别或者分泌新的效应分子干扰ETI[7]。效应分子转录的精确编程对于大豆疫霉的致病性非常重要，效应分子之间相互协作以“团队作战”的方式干扰植物的抗病反应，促进病原菌的侵染[8]。
根据课题组之前对大豆疫霉效应分子Avh262的研究结果，Avh262在大豆疫霉侵染寄主的初期上调表达，属于侵染初期显著上调表达的效应分子，并且能够能够促进疫霉的侵染，抑制Bax，INF1?和effectors引起的细胞死亡，从而抑制植物的免疫反应，这些都说明Avh262在侵染过程中起着重要的作用。本课题为了确定在侵染寄主大豆时Avh262对大豆疫霉毒性的贡献，拟得到大豆疫霉Avh262稳定沉默转化子。然后进行致病力测定，通过对转化子的致病性分析，确定其是否是大豆疫霉毒性所必需的效应分子，初步探讨其在大豆疫霉侵染大豆的过程中的毒性功能。
1 材料与方法
1．1 供试大豆疫霉菌株和植物的培养
大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株JM109为本实验室保存。
大豆疫霉（Phytophthora sojae）菌株P6497为Brett M. Tyler教授（美国Virginia生物信息研究所）馈赠，菌株于10%V8固体斜面培养基上，10℃保存。所有转移和保存P.soje的方法严格按照标准程序[10]处理。
实验中所用到的大豆品种是感病品种合丰47，釆用的是大豆的黄豆苗。具体培养方法是：将蛭石用水浸透，将大豆种子埋种到土下1 cm深度。在黑暗条件下25 ℃培养3到4天，以豆子出土3公分高度适宜。
1.2 大豆疫霉游动孢子接种黄豆苗
1.2.1 游动孢子的诱导
将新鲜的在10%V8培养基上生长的大豆疫霉菌丝块切成2×2 mm的菌丝块，25℃培养于10%的液体V8汁培养基中。3天后，将液体V8培养基倒掉，并用自来水冲洗三次将培养液完全洗净后，加入少量的自来水，以高度不能完全没过菌丝为适宜。25℃黑暗培养过夜。第二天计数游动孢子。
1.2.2 游动孢子接种黄豆苗
将黄豆苗从土中连根拔出，固定于塑料托盘中，下面垫上吸水纸加少量水保湿。将上述诱导出来的游动孢子计数后用移液器吸取100个游动孢子的悬浮液滴于黄豆苗的茎上。每份游动孢子接种5株黄豆苗。接种后将黄豆苗下面未接种的区域和根部用吸水纸覆盖加水保湿。然后将托盘覆盖上保鲜膜防止水分蒸发，将托盘黑暗25℃放置。
1. 3 RTPCR分析Avh262在大豆疫霉生活史阶段的表达
分别提取大豆疫霉菌丝、以及大豆疫霉侵染大豆1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h的总RNA。菌丝的培养采用10%V8固体培养基，选取菌落边缘幼嫩的菌丝，切成2×2 mm的菌丝块，置于20 mL10%V8培养液中，于25℃黑暗静置培养3 d。
孢子囊的诱导产生、游动孢子的释放参照郑小波[11]的方法。侵染阶段的RNA提取具体方法为，将新鲜液培的菌丝团塞到大豆下胚轴的纵切面中，分别于1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h将大豆下胚轴内含菌丝一起提取总RNA。RNA的提取采用Nucleo Spin RNAⅡkit。总RNA经过Prime Script RTPCR试剂盒（TaKaRa）反转录的到sscDNA，以sscDNA为模板进行RTPCR分析Avh262的各阶段表达情况，Avh262和内参Actin的RTPCR引物见表11。
表11构建载体及定量PCR所用的引物
Table 11 primers list
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1供试大豆疫霉菌株和植物的培养2
1.2大豆疫霉游动孢子接种黄豆苗 2
1.2.1游动孢子的诱导2
1.2.2游动孢子接种黄豆苗2
1.3 RTPCR分析Avh262在大豆疫霉生活史阶段的表达 3
1.3.1 RNA的提取及反转录 3
1.3.2逆转录合成sscDNA4
1.4大豆疫霉Avh262效应分子序列多态性分析4
1.4.1数据获取 4
1.4.2大豆疫霉基因组的提取 4
1.4.3 验证大豆疫霉效应分子序列可靠性 5
1.4.4 多态性分析 5
1.5大豆疫霉Avh262基因的沉默 5
1.5.1 沉默转化载体的构建 5
1.5.2大豆疫霉PEG介导的原生质体转化 5
1.6 稳定沉默转化子的筛选 7
1.7稳定沉默转化子的致病力分析 7
2结果与分析 7
2.1 Avh262在大豆疫霉生活史阶段的基因表达 7
2.2 Avh262在大豆疫霉侵染寄主过程中的毒性贡
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
献 8
3讨论 9
致谢9
参考文献10
大豆疫霉RxLR效应分子Avh262
稳定沉默转化子的筛选和致病性分析
引言
大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一，每年导致全球十几亿美元的直接经济损失[1]。研究大豆疫霉侵染大豆过程中效应分子的作用机制对于进一步揭示在与寄主互作过程中的病原菌的侵染机制非常重要。
植物病原卵菌在与寄主植物互作的过程中，会分泌效应分子（effectors）[2]进入寄主细胞中，通过破坏或者干扰细胞代谢途径，在植物细胞内发挥毒性功能、抑制植物的免疫反应、帮助病原菌的侵染。通过生物信息学的比对以及卵菌基因组测序的不断发展，在疫霉的基因组中发现了一类大量存在的效应分子，这一类效应分子的共同特点是在N端都含有一个信号肽，后面紧随着一个保守的RxLRdEER motif[34]，我们称其为RxLR效应分子。最近发现效应分子的RxLR功能域可以与寄主细胞膜上的P13P结合，帮助效应分子进入寄主细胞内[5]。
本实验室之前对大豆疫霉RxLR效应分子的功能进行大规模的筛选，发现大多效应分子都能够抑制植物的细胞死亡，也有部分效应分子可以直接诱导植物免疫反应。在侵染初期显著上调表达的效应分子主要作用是抑制植物对病原菌识别产生的PTI(PAMPtriggered immunity) [6] ，是一种普遍存在但强度较弱的抗性, 可以抵抗多数病原菌的侵染；组成型高表达的效应分子则与抑制ETI(Effectortriggered immunity)有关，寄主又通过NBSLRR类抗病蛋白识别效应分子产生新的免疫反应ETI；病原菌则通过效应分子的变异逃避识别或者分泌新的效应分子干扰ETI[7]。效应分子转录的精确编程对于大豆疫霉的致病性非常重要，效应分子之间相互协作以“团队作战”的方式干扰植物的抗病反应，促进病原菌的侵染[8]。
根据课题组之前对大豆疫霉效应分子Avh262的研究结果，Avh262在大豆疫霉侵染寄主的初期上调表达，属于侵染初期显著上调表达的效应分子，并且能够能够促进疫霉的侵染，抑制Bax，INF1?和effectors引起的细胞死亡，从而抑制植物的免疫反应，这些都说明Avh262在侵染过程中起着重要的作用。本课题为了确定在侵染寄主大豆时Avh262对大豆疫霉毒性的贡献，拟得到大豆疫霉Avh262稳定沉默转化子。然后进行致病力测定，通过对转化子的致病性分析，确定其是否是大豆疫霉毒性所必需的效应分子，初步探讨其在大豆疫霉侵染大豆的过程中的毒性功能。
1 材料与方法
1．1 供试大豆疫霉菌株和植物的培养
大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株JM109为本实验室保存。
大豆疫霉（Phytophthora sojae）菌株P6497为Brett M. Tyler教授（美国Virginia生物信息研究所）馈赠，菌株于10%V8固体斜面培养基上，10℃保存。所有转移和保存P.soje的方法严格按照标准程序[10]处理。
实验中所用到的大豆品种是感病品种合丰47，釆用的是大豆的黄豆苗。具体培养方法是：将蛭石用水浸透，将大豆种子埋种到土下1 cm深度。在黑暗条件下25 ℃培养3到4天，以豆子出土3公分高度适宜。
1.2 大豆疫霉游动孢子接种黄豆苗
1.2.1 游动孢子的诱导
将新鲜的在10%V8培养基上生长的大豆疫霉菌丝块切成2×2 mm的菌丝块，25℃培养于10%的液体V8汁培养基中。3天后，将液体V8培养基倒掉，并用自来水冲洗三次将培养液完全洗净后，加入少量的自来水，以高度不能完全没过菌丝为适宜。25℃黑暗培养过夜。第二天计数游动孢子。
1.2.2 游动孢子接种黄豆苗
将黄豆苗从土中连根拔出，固定于塑料托盘中，下面垫上吸水纸加少量水保湿。将上述诱导出来的游动孢子计数后用移液器吸取100个游动孢子的悬浮液滴于黄豆苗的茎上。每份游动孢子接种5株黄豆苗。接种后将黄豆苗下面未接种的区域和根部用吸水纸覆盖加水保湿。然后将托盘覆盖上保鲜膜防止水分蒸发，将托盘黑暗25℃放置。
1. 3 RTPCR分析Avh262在大豆疫霉生活史阶段的表达
分别提取大豆疫霉菌丝、以及大豆疫霉侵染大豆1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h的总RNA。菌丝的培养采用10%V8固体培养基，选取菌落边缘幼嫩的菌丝，切成2×2 mm的菌丝块，置于20 mL10%V8培养液中，于25℃黑暗静置培养3 d。
孢子囊的诱导产生、游动孢子的释放参照郑小波[11]的方法。侵染阶段的RNA提取具体方法为，将新鲜液培的菌丝团塞到大豆下胚轴的纵切面中，分别于1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h将大豆下胚轴内含菌丝一起提取总RNA。RNA的提取采用Nucleo Spin RNAⅡkit。总RNA经过Prime Script RTPCR试剂盒（TaKaRa）反转录的到sscDNA，以sscDNA为模板进行RTPCR分析Avh262的各阶段表达情况，Avh262和内参Actin的RTPCR引物见表11。
表11构建载体及定量PCR所用的引物
Table 11 primers list
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