苹果绵蚜的抗性监测及其机制的初步研究(附件)
为了掌握果树重要害虫苹果绵蚜的抗性动态，本研究测定了山东济南、江苏丰县和新疆察布查尔苹果绵蚜对常规药剂毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和吡虫啉的敏感性，并比较其解毒酶的活力水平。以察布察尔2012苹果绵蚜为相对敏感种群，结果发现，济南、丰县和察布查尔种群对吡虫啉都达到极高水平的抗性，对毒死蜱为中等到极高水平抗性，对高效氯氟氰菊酯产生了高到极高水平的抗性；解毒酶活力结果显示济南和察布察尔苹果绵蚜的全酯酶活力明显高于丰县种群；察布察尔和丰县苹果绵蚜谷胱甘肽S-转移酶活力明显高于济南种群。本研究结果表明，我国苹果绵蚜已对吡虫啉、毒死蜱和高效氯氟氰菊酯产生了不同程度的抗性，其中对吡虫啉的抗性程度最为严重，防治中应注意减少施药频率，合理轮换药剂。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言2
1材料与试验方法2
1.1试验材料2
1.1.1供试虫源2
1.1.2供试药剂2
1.1.3供试试剂2
1.2试验方法3
1.2.1室内毒力测定方法3
1.2.2解毒酶活力的测定3
1.2.2.1酶液的制取3
1.2.2.2酯酶活力测定3
1.2.2.3谷胱甘肽S转移酶活力测定3
1.2.2.4总蛋白含量测定3
1.3数据统计与分析3
2结果与分析3
2.1室内毒力测定试验4
2.2解毒酶活力测定4
2.3解毒酶活力与抗性倍数的相关性分析5
3讨论6
致谢7
参考文献7
苹果绵蚜的抗性监测及机制的初步研究
沈雅楠
引言
苹果绵蚜属同翅目瘿绵蚜科绵蚜属，又名血色蚜虫、赤蚜、绵蚜。是苹果上一种重要的检疫性害虫[1]。苹果绵蚜以无翅胎生成虫及若虫密集于背光的病虫伤口、剪锯口、老树皮裂缝、新梢的叶腋、短果枝的端部、果柄、果实的梗洼和萼洼处以及地下根部和露出地表的根际等处刺吸危害吸取果树汁液，消耗果树营养，使树势衰弱。在被害处形成瘤状突起，严重时肿瘤累累，木质部变为 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
黑褐色坏死，受害根不再长须根，失去吸收能力。受害轻的影响产量；严重时可造成全株枯死[2,3,4]。苹果绵蚜于1914年首次在我国山东青岛发生，目前在我国分布省份广泛，造成严重危害。综合相关文献报道和调查，苹果绵蚜在中国的入侵途径有3个：一是从朝鲜、日本传入我国山东、辽宁，然后随种苗调运等扩散传播到河北、河南、山西、陕西、甘肃、新疆及贵州、西藏等各省(市、自治区)的部分地区；二是由美国传教士携带种苗传入云南,并在云南省内扩散；三是从印度随种苗传入西藏 [5,6,7] 。
吡虫啉属于新烟碱类杀虫剂，于 1991年面市。对飞虱、叶蝉、粉虱、蚜虫、介壳虫等同翅目害虫的防治，在高效持效上吡虫啉都显著优于常规药剂。目前，吡虫啉已经成为防治上述害虫的首选农药品种[8]。毒死蜱属于有机磷类杀虫剂，是目前全球应用最广泛的五种杀虫剂之一。毒死蜱具有触杀、胃毒和熏蒸作用,对防治螟虫、卷叶虫、粘虫、介壳虫、叶蝉和害螨等百余种农业害虫有特效[9]。菊酯类杀虫剂是在模拟天然除虫菊花的有效成分的基础上，进行人工合成的，高效、低毒、低残留、安全的广谱性新型杀虫剂，具有击倒速度快，击倒力强，用药量少，耐雨水冲刷等优点，是传统的有机氯、有机磷杀虫剂的理想替代品。菊酯类农药可防治鳞翅目、同翅目、双翅目、直翅目、鞘翅目的害虫[10]。目前这些杀虫剂都是防治苹果绵蚜的主要药剂。
化学防治是目前控制苹果绵蚜危害的主要方法，长期频繁的使用杀虫剂势必造成抗药性的产生。目前关于苹果绵蚜的抗药性方面的相关报道不多。开展抗性监测是制定合理防治策略的重要前提。本课题主要通过测定苹果绵蚜对常规药剂毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和吡虫啉的敏感性水平，了解各地区种群的抗性水平及分布，并通过分析各地区苹果绵蚜种群解毒酶活力，初步探索了苹果绵蚜生抗药性产的可能机制。
1材料和试验方法
1.1试验材料
1.1.1供试虫源
2015年7月至10月，采集山东省济南、江苏省徐州丰县和新疆伊犁市察布查尔县三个地区的苹果绵蚜进行试验。用软毛笔轻轻将苹果绵蚜从苹果树枝上扫下来，选取健康的四齢若虫或无翅成蚜作为标准试虫。
1.1.2供试药剂
480g/L毒死蜱乳油制剂，购自济南一农化工有限公司；200g/L吡虫啉乳油制剂，购自上海金正达化工科技有限公司；25g/L高效氯氟氰菊酯乳油制剂，购自青岛欧迪斯生物科技有限公司；
原药：96.5%毒死蜱原药、97%吡虫啉原药，均由南京红太阳股份有限公司提供，97%高效氯氟氰菊酯原药由南京艾津农化有限责任公司提供。
1.1.3供试试剂
α乙酸萘酯（αNA）、考马斯亮蓝G250 、固蓝RR盐、 1氯2,4二硝基苯（CDNB）、还原性谷胱甘肽（GSH）均由北京Solarbio生产；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均属于科龙化工试剂有限公司；丙酮、无水乙醇均为上海凌峰化学试剂有限公司。
1.2试验方法
1.2.1室内毒力测定方法
室内毒力测定采用浸叶法。用清水将杀虫剂配制成所需系列浓度梯度的药液。选取新鲜的苹果叶片连枝一起剪下，用清水洗净并用吸水纸吸干多余水分。将叶片浸在不同浓度的药剂中10 s后取出,反面朝上放置在吸水纸上自然晾干，再将叶片放在垫有滤纸的培养皿（直径9 cm）中。选取标准试虫接种到处理的苹果叶片上，每个处理20头苹果绵蚜，重复3次。以清水作为对照。防止蚜虫逃逸，培养皿用保鲜膜封严，每皿用小针扎10个孔透气，置于27(2℃养虫室中。吡虫啉处理5h，毒死蜱和高效氯氟氰菊酯处理3h后检查苹果绵蚜死亡数，并计算LC50。
1.2.2解毒酶活力的测定
1.2.2.1酶液的制取
取苹果绵蚜标准试虫，以60头苹果绵蚜(约2030 mg)作为一个样本，每个样本加入600(L 0.1M pH7.8匀浆缓冲溶液用匀浆器进行群体匀浆，直至无明显组织块为止，重复3次。整个匀浆过程在冰上进行。取匀浆液在4℃、12000 g离心机（德国Eppendoff公司）20 min，取上清液再次离心10 min，得上清液即为粗酶液，置于冰上待用。
1.2.2.2酯酶活力测定
用(乙酸萘酯（(NA）作为底物，测定非特异性酯酶的活力。20 mg固蓝RR盐和10 mg (NA（先溶于1 mL丙酮）用0.2M pH6.0磷酸缓冲液定容到25mL，混合均匀后过滤得黄色澄清的底物和显色混合液，此液需现配现用。在96孔板中依次加入50(L所得酶液、150(L上述底物和显色混合液。利用酶标仪在450 nm下记录光密度值，反应在27°C下进行，每25秒读取一个点，共记录10 min。每个种群重复三次，以反应速度表示酶活力(mOD/min(mg)。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言2
1材料与试验方法2
1.1试验材料2
1.1.1供试虫源2
1.1.2供试药剂2
1.1.3供试试剂2
1.2试验方法3
1.2.1室内毒力测定方法3
1.2.2解毒酶活力的测定3
1.2.2.1酶液的制取3
1.2.2.2酯酶活力测定3
1.2.2.3谷胱甘肽S转移酶活力测定3
1.2.2.4总蛋白含量测定3
1.3数据统计与分析3
2结果与分析3
2.1室内毒力测定试验4
2.2解毒酶活力测定4
2.3解毒酶活力与抗性倍数的相关性分析5
3讨论6
致谢7
参考文献7
苹果绵蚜的抗性监测及机制的初步研究
沈雅楠
引言
苹果绵蚜属同翅目瘿绵蚜科绵蚜属，又名血色蚜虫、赤蚜、绵蚜。是苹果上一种重要的检疫性害虫[1]。苹果绵蚜以无翅胎生成虫及若虫密集于背光的病虫伤口、剪锯口、老树皮裂缝、新梢的叶腋、短果枝的端部、果柄、果实的梗洼和萼洼处以及地下根部和露出地表的根际等处刺吸危害吸取果树汁液，消耗果树营养，使树势衰弱。在被害处形成瘤状突起，严重时肿瘤累累，木质部变为 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
黑褐色坏死，受害根不再长须根，失去吸收能力。受害轻的影响产量；严重时可造成全株枯死[2,3,4]。苹果绵蚜于1914年首次在我国山东青岛发生，目前在我国分布省份广泛，造成严重危害。综合相关文献报道和调查，苹果绵蚜在中国的入侵途径有3个：一是从朝鲜、日本传入我国山东、辽宁，然后随种苗调运等扩散传播到河北、河南、山西、陕西、甘肃、新疆及贵州、西藏等各省(市、自治区)的部分地区；二是由美国传教士携带种苗传入云南,并在云南省内扩散；三是从印度随种苗传入西藏 [5,6,7] 。
吡虫啉属于新烟碱类杀虫剂，于 1991年面市。对飞虱、叶蝉、粉虱、蚜虫、介壳虫等同翅目害虫的防治，在高效持效上吡虫啉都显著优于常规药剂。目前，吡虫啉已经成为防治上述害虫的首选农药品种[8]。毒死蜱属于有机磷类杀虫剂，是目前全球应用最广泛的五种杀虫剂之一。毒死蜱具有触杀、胃毒和熏蒸作用,对防治螟虫、卷叶虫、粘虫、介壳虫、叶蝉和害螨等百余种农业害虫有特效[9]。菊酯类杀虫剂是在模拟天然除虫菊花的有效成分的基础上，进行人工合成的，高效、低毒、低残留、安全的广谱性新型杀虫剂，具有击倒速度快，击倒力强，用药量少，耐雨水冲刷等优点，是传统的有机氯、有机磷杀虫剂的理想替代品。菊酯类农药可防治鳞翅目、同翅目、双翅目、直翅目、鞘翅目的害虫[10]。目前这些杀虫剂都是防治苹果绵蚜的主要药剂。
化学防治是目前控制苹果绵蚜危害的主要方法，长期频繁的使用杀虫剂势必造成抗药性的产生。目前关于苹果绵蚜的抗药性方面的相关报道不多。开展抗性监测是制定合理防治策略的重要前提。本课题主要通过测定苹果绵蚜对常规药剂毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和吡虫啉的敏感性水平，了解各地区种群的抗性水平及分布，并通过分析各地区苹果绵蚜种群解毒酶活力，初步探索了苹果绵蚜生抗药性产的可能机制。
1材料和试验方法
1.1试验材料
1.1.1供试虫源
2015年7月至10月，采集山东省济南、江苏省徐州丰县和新疆伊犁市察布查尔县三个地区的苹果绵蚜进行试验。用软毛笔轻轻将苹果绵蚜从苹果树枝上扫下来，选取健康的四齢若虫或无翅成蚜作为标准试虫。
1.1.2供试药剂
480g/L毒死蜱乳油制剂，购自济南一农化工有限公司；200g/L吡虫啉乳油制剂，购自上海金正达化工科技有限公司；25g/L高效氯氟氰菊酯乳油制剂，购自青岛欧迪斯生物科技有限公司；
原药：96.5%毒死蜱原药、97%吡虫啉原药，均由南京红太阳股份有限公司提供，97%高效氯氟氰菊酯原药由南京艾津农化有限责任公司提供。
1.1.3供试试剂
α乙酸萘酯（αNA）、考马斯亮蓝G250 、固蓝RR盐、 1氯2,4二硝基苯（CDNB）、还原性谷胱甘肽（GSH）均由北京Solarbio生产；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均属于科龙化工试剂有限公司；丙酮、无水乙醇均为上海凌峰化学试剂有限公司。
1.2试验方法
1.2.1室内毒力测定方法
室内毒力测定采用浸叶法。用清水将杀虫剂配制成所需系列浓度梯度的药液。选取新鲜的苹果叶片连枝一起剪下，用清水洗净并用吸水纸吸干多余水分。将叶片浸在不同浓度的药剂中10 s后取出,反面朝上放置在吸水纸上自然晾干，再将叶片放在垫有滤纸的培养皿（直径9 cm）中。选取标准试虫接种到处理的苹果叶片上，每个处理20头苹果绵蚜，重复3次。以清水作为对照。防止蚜虫逃逸，培养皿用保鲜膜封严，每皿用小针扎10个孔透气，置于27(2℃养虫室中。吡虫啉处理5h，毒死蜱和高效氯氟氰菊酯处理3h后检查苹果绵蚜死亡数，并计算LC50。
1.2.2解毒酶活力的测定
1.2.2.1酶液的制取
取苹果绵蚜标准试虫，以60头苹果绵蚜(约2030 mg)作为一个样本，每个样本加入600(L 0.1M pH7.8匀浆缓冲溶液用匀浆器进行群体匀浆，直至无明显组织块为止，重复3次。整个匀浆过程在冰上进行。取匀浆液在4℃、12000 g离心机（德国Eppendoff公司）20 min，取上清液再次离心10 min，得上清液即为粗酶液，置于冰上待用。
1.2.2.2酯酶活力测定
用(乙酸萘酯（(NA）作为底物，测定非特异性酯酶的活力。20 mg固蓝RR盐和10 mg (NA（先溶于1 mL丙酮）用0.2M pH6.0磷酸缓冲液定容到25mL，混合均匀后过滤得黄色澄清的底物和显色混合液，此液需现配现用。在96孔板中依次加入50(L所得酶液、150(L上述底物和显色混合液。利用酶标仪在450 nm下记录光密度值，反应在27°C下进行，每25秒读取一个点，共记录10 min。每个种群重复三次，以反应速度表示酶活力(mOD/min(mg)。
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