中华按蚊荧光原位杂交
疟疾是一种在世界各地均有发生的急性传染病，它严重危害着人类的健康。疟疾由疟疾原虫引起，并能通过雌性按蚊的叮咬在人群中广泛传播。在我国，中华按蚊是疟疾的主要传播媒介，杀灭按蚊能够有效的阻碍疟疾的传播，因此防治中华按蚊对我国疟疾治理起着重要的作用。按蚊也是一种用于研究多线染色体的模式昆虫，我国很早就有相关方面的研究，但由于年代和技术的限制，这些研究中绘制的多线染色体图谱大多缺乏通用性。并且目前我国仍然缺乏高分辨率的中华按蚊物理图谱。荧光原位杂交技术作为一门新兴的分子标记技术，与传统的放射性标记原位杂交技术相比，具有快速、灵敏度高、检测信号强的特点，可以用于确定DNA或cDNA克隆在其染色体上的精确位置以及基因片段的方向性，为中华按蚊物理图谱的构建提供了技术支持。中华按蚊物理图谱的构建将会对中华按蚊全基因组测序工作的全面启动和完成起到积极地推动和完善作用，并能够为中华按蚊防治提供细胞分子层面的依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1.材料与方法 3
1.1供试蚊虫和实验仪器 3
1.2实验方法 4
1.2.1解剖材料的制备 4
1.2.2多线染色体玻片的制备 4
1.3荧光探针的制备 4
1.3.1引物设计 4
1.3.2中华按蚊基因组总DNA提取 4
1.3.3目标DNA片段扩增 5
1.4目标片段回收 6
1.5荧光探针的制作 7
1.6荧光探针与多线染色体杂交 7
1.6.1预杂交 7
1.6.2荧光原位杂交 7
1.6.3洗玻片 8
1.6.4 信号的观察与定位 8
2.结果与分析 8
2.1目标片段扩增与回收结果 8
2.2原位杂交镜检结果 9
3.讨论 12
致谢 13
参考文献 13
中华按蚊荧光原位杂交
引言
疟疾（malaria）是由一种由疟原虫（Plasmodium）引起的， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
可以通过雌性按蚊（Anopheles）叮咬传播的全球性急性寄生虫传染病[1]。疟疾是联合国千年发展目标中需重点防控的三种传染病之一，它和艾滋病、结核病一起被世界卫生组织列为全球急需控制的三大公共卫生问题。根世界卫生组织估计，全世界每年有一亿以上的疟疾病例需要治疗。在蚊虫肆虐的热带地区，由于蚊虫的孳生不可能完全清除，疟疾的广泛传播成为了一个棘手的难题。据统计，非洲地区仅每年死于疟疾的14岁以下儿童人数就超过了100万[2]。这种疾病带来的各种危害与影响也使它成为阻碍非洲众多地区经济发展的原因之一。在我国，疟疾曾严重危害人民身心健康和生命安全。直到2010年，统计数字显示我国23个省1191个县仍有7855例的疟疾病例报告，所以我国在实现“零疟疾”的目标上仍然任重而道远[3]。按蚊属包含有6个亚属，其中包括赛蚊亚属(Cellia)、按蚊亚属(Anopheles)、Lophopodomyia亚属、Stethomyia亚属、刺蚊亚属(Nyssorhynchus)[4]。中华按蚊隶属于按蚊属，是赫坎按蚊种团(An. Hyrcanus group)的一员。它分布于我国除青海、新疆外的各省（自治区、 直辖市），是广大平原地区，特别是水稻种植地区疟疾传播的重要媒介[5]，因此对中华按蚊的防治不容忽视。能够引起疟疾的疟原虫主要有四种：卵形疟原虫(P. ovale)、恶性疟原虫(P. falciparum)、间日疟原虫(P. vivax)和三日疟原虫(P. malariae)[6]。其中间日疟原虫的传播主要依靠中华按蚊。由于蚊虫对各种环境都具有强大的适应能力，使得它们能够在各种地理环境和人类的居住空间中大量繁殖，从而让疟疾的防控充满难度[7]。同时又因为不同按蚊种群的防治方法不同，防治按蚊变得更加艰难。确定我国不同疟疾流行区域按蚊种群构成，在进行防治时根据种群类别选择不同的防治策略和技术方案，可以有效地提高按蚊防治效果。一般来说，依靠按蚊的外部形态特征来鉴定品种是最为简便的方法，但许多外部特征的描述都是较为模糊且主观性较强的，一些近似种在外部形态上也并不具有太大的区别——这些因素都容易造成鉴定的结果不准确。然而，按蚊具有结构特征明显的染色体，不同物种的按蚊体内的多线染色带型也不尽相同。通过荧光原位杂交技术建立高分辨率的多线染色体图谱和染色体物理图谱，能够对种群鉴定，特别是近似种或近缘种的鉴定起到积极地作用。
按蚊不仅是疟疾传播的媒介昆虫，也是用于研究多线染色体的模式昆虫之一。多线染色体是一种巨大的线状染色体，它的形成是由于某些细胞内，DNA多次复制但细胞未进行细胞分裂，复制过程中形成的大量子染色体紧密排列，并阻止了染色质的进一步包装，最终在细胞内形成了具有明暗相间条带的多线染色体。在按蚊的肠，唾液腺，马氏管和卵巢营养细胞中均有多线染色体的分布[8]。按蚊染色体组由6条染色体组成：X染色体、Y染色体以及两对常染色体。由于其本身的异染色质性质，按蚊的Y染色体无法形成多线染色体[9]。将常染色体以其着丝粒为界进行划分，按蚊的多线染色体便被划分成了五条染色体臂：X、2L、2R、3L和3R。我国对中华按蚊多线染色体的研究由来已久，最早开始于80年代叶炳辉等绘制的南京中华按蚊染色体图谱[10]。徐秀芬，王仲文等制定了郑州地区的中华按蚊唾腺染色体图型[11]。随后叶炳辉等发表了南京中华按蚊染色体图谱，并比较了徐州和宜兴两地株的唾腺染色体[12]。许漱璧,谭璟宪采用分带技术对中华按蚊核型进行了研究[13]。但是，在这些研究与实验中完成的多线染色体图谱均为手绘图谱，这种手绘图谱的主观性强，与实际多线染色体差异大，并不能体现多线染色体图谱的优点，也不能为针对中华按蚊的各种后续研究带来便利。直到2015年，梁江涛等在前人的基础上，利用荧光原位杂交技术，构建了一副高分辨率的中华按蚊染色体图谱并对其进行了区和亚区的划分[14]，才使得人们对我国这种媒介按蚊在分子细胞层面的研究有了进一步的深入。
在寻求疟疾防控的新思路和新方法上，科学家们对按蚊物理图谱构建的重视程度不断提高。Graziosi 等第一次将荧光素标记的DNA探针精确定位到冈比亚按蚊多线染色体上[15]，为按蚊物理图谱研究工作的开展打下了坚实基础。随后Zheng等人利用荧光原位杂交技术构建出了第一幅冈比亚按蚊的物理图谱，但其分辨率较低,仅包含46个克隆[16]。在此之后，微卫星DNA(Microsatellite DNA）[17]、随机扩增多态性DNA(RAPD)[18]、黏粒(cosmids)和cDNA克隆等也被定位在了冈比亚按蚊的染色体上。Cornel等研究了按蚊染色体臂的共线性关系并将17个基因定位到了淡色按蚊(An. albimanus)的染色体上，从而构建了淡色按蚊的物理图谱[19]。非洲冈比亚按蚊物理图谱最早开始构建，与此同时它也是目前基因组组装最完整的一个蚊种。而缺少相应的物理图谱的库蚊属(Culex)和伊蚊属(Aedes)的蚊虫全基因组组装进展就较缓慢。如库蚊属的致倦库蚊（Cx. pipiens quinquefasciatus）被定位到染色体上的基因只占全基因组序列的38%[20]。在伊蚊属埃及伊蚊（Aedes agypti）基因组测序完成后，其基因组序列也仅有约31%被定位到了染色体上[21]。直到2013年，大约只有183 Mbp的序列被定位到埃及伊蚊的中期染色体上[22]。除了为基因组组装提供帮助外，2000年Ranson等在冈比亚按蚊上发现了一个与DDT抗药性相关的数量性状基因座，这与冈比亚按蚊染色体图谱和物理图谱的发表也有很大的关系[23]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1.材料与方法 3
1.1供试蚊虫和实验仪器 3
1.2实验方法 4
1.2.1解剖材料的制备 4
1.2.2多线染色体玻片的制备 4
1.3荧光探针的制备 4
1.3.1引物设计 4
1.3.2中华按蚊基因组总DNA提取 4
1.3.3目标DNA片段扩增 5
1.4目标片段回收 6
1.5荧光探针的制作 7
1.6荧光探针与多线染色体杂交 7
1.6.1预杂交 7
1.6.2荧光原位杂交 7
1.6.3洗玻片 8
1.6.4 信号的观察与定位 8
2.结果与分析 8
2.1目标片段扩增与回收结果 8
2.2原位杂交镜检结果 9
3.讨论 12
致谢 13
参考文献 13
中华按蚊荧光原位杂交
引言
疟疾（malaria）是由一种由疟原虫（Plasmodium）引起的， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
可以通过雌性按蚊（Anopheles）叮咬传播的全球性急性寄生虫传染病[1]。疟疾是联合国千年发展目标中需重点防控的三种传染病之一，它和艾滋病、结核病一起被世界卫生组织列为全球急需控制的三大公共卫生问题。根世界卫生组织估计，全世界每年有一亿以上的疟疾病例需要治疗。在蚊虫肆虐的热带地区，由于蚊虫的孳生不可能完全清除，疟疾的广泛传播成为了一个棘手的难题。据统计，非洲地区仅每年死于疟疾的14岁以下儿童人数就超过了100万[2]。这种疾病带来的各种危害与影响也使它成为阻碍非洲众多地区经济发展的原因之一。在我国，疟疾曾严重危害人民身心健康和生命安全。直到2010年，统计数字显示我国23个省1191个县仍有7855例的疟疾病例报告，所以我国在实现“零疟疾”的目标上仍然任重而道远[3]。按蚊属包含有6个亚属，其中包括赛蚊亚属(Cellia)、按蚊亚属(Anopheles)、Lophopodomyia亚属、Stethomyia亚属、刺蚊亚属(Nyssorhynchus)[4]。中华按蚊隶属于按蚊属，是赫坎按蚊种团(An. Hyrcanus group)的一员。它分布于我国除青海、新疆外的各省（自治区、 直辖市），是广大平原地区，特别是水稻种植地区疟疾传播的重要媒介[5]，因此对中华按蚊的防治不容忽视。能够引起疟疾的疟原虫主要有四种：卵形疟原虫(P. ovale)、恶性疟原虫(P. falciparum)、间日疟原虫(P. vivax)和三日疟原虫(P. malariae)[6]。其中间日疟原虫的传播主要依靠中华按蚊。由于蚊虫对各种环境都具有强大的适应能力，使得它们能够在各种地理环境和人类的居住空间中大量繁殖，从而让疟疾的防控充满难度[7]。同时又因为不同按蚊种群的防治方法不同，防治按蚊变得更加艰难。确定我国不同疟疾流行区域按蚊种群构成，在进行防治时根据种群类别选择不同的防治策略和技术方案，可以有效地提高按蚊防治效果。一般来说，依靠按蚊的外部形态特征来鉴定品种是最为简便的方法，但许多外部特征的描述都是较为模糊且主观性较强的，一些近似种在外部形态上也并不具有太大的区别——这些因素都容易造成鉴定的结果不准确。然而，按蚊具有结构特征明显的染色体，不同物种的按蚊体内的多线染色带型也不尽相同。通过荧光原位杂交技术建立高分辨率的多线染色体图谱和染色体物理图谱，能够对种群鉴定，特别是近似种或近缘种的鉴定起到积极地作用。
按蚊不仅是疟疾传播的媒介昆虫，也是用于研究多线染色体的模式昆虫之一。多线染色体是一种巨大的线状染色体，它的形成是由于某些细胞内，DNA多次复制但细胞未进行细胞分裂，复制过程中形成的大量子染色体紧密排列，并阻止了染色质的进一步包装，最终在细胞内形成了具有明暗相间条带的多线染色体。在按蚊的肠，唾液腺，马氏管和卵巢营养细胞中均有多线染色体的分布[8]。按蚊染色体组由6条染色体组成：X染色体、Y染色体以及两对常染色体。由于其本身的异染色质性质，按蚊的Y染色体无法形成多线染色体[9]。将常染色体以其着丝粒为界进行划分，按蚊的多线染色体便被划分成了五条染色体臂：X、2L、2R、3L和3R。我国对中华按蚊多线染色体的研究由来已久，最早开始于80年代叶炳辉等绘制的南京中华按蚊染色体图谱[10]。徐秀芬，王仲文等制定了郑州地区的中华按蚊唾腺染色体图型[11]。随后叶炳辉等发表了南京中华按蚊染色体图谱，并比较了徐州和宜兴两地株的唾腺染色体[12]。许漱璧,谭璟宪采用分带技术对中华按蚊核型进行了研究[13]。但是，在这些研究与实验中完成的多线染色体图谱均为手绘图谱，这种手绘图谱的主观性强，与实际多线染色体差异大，并不能体现多线染色体图谱的优点，也不能为针对中华按蚊的各种后续研究带来便利。直到2015年，梁江涛等在前人的基础上，利用荧光原位杂交技术，构建了一副高分辨率的中华按蚊染色体图谱并对其进行了区和亚区的划分[14]，才使得人们对我国这种媒介按蚊在分子细胞层面的研究有了进一步的深入。
在寻求疟疾防控的新思路和新方法上，科学家们对按蚊物理图谱构建的重视程度不断提高。Graziosi 等第一次将荧光素标记的DNA探针精确定位到冈比亚按蚊多线染色体上[15]，为按蚊物理图谱研究工作的开展打下了坚实基础。随后Zheng等人利用荧光原位杂交技术构建出了第一幅冈比亚按蚊的物理图谱，但其分辨率较低,仅包含46个克隆[16]。在此之后，微卫星DNA(Microsatellite DNA）[17]、随机扩增多态性DNA(RAPD)[18]、黏粒(cosmids)和cDNA克隆等也被定位在了冈比亚按蚊的染色体上。Cornel等研究了按蚊染色体臂的共线性关系并将17个基因定位到了淡色按蚊(An. albimanus)的染色体上，从而构建了淡色按蚊的物理图谱[19]。非洲冈比亚按蚊物理图谱最早开始构建，与此同时它也是目前基因组组装最完整的一个蚊种。而缺少相应的物理图谱的库蚊属(Culex)和伊蚊属(Aedes)的蚊虫全基因组组装进展就较缓慢。如库蚊属的致倦库蚊（Cx. pipiens quinquefasciatus）被定位到染色体上的基因只占全基因组序列的38%[20]。在伊蚊属埃及伊蚊（Aedes agypti）基因组测序完成后，其基因组序列也仅有约31%被定位到了染色体上[21]。直到2013年，大约只有183 Mbp的序列被定位到埃及伊蚊的中期染色体上[22]。除了为基因组组装提供帮助外，2000年Ranson等在冈比亚按蚊上发现了一个与DDT抗药性相关的数量性状基因座，这与冈比亚按蚊染色体图谱和物理图谱的发表也有很大的关系[23]。
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