大豆疫霉无毒效应分子avr3b调节植物细胞内nad(p)nad(p)h水平及氧化还原平衡
摘要：大豆是世界上重要的粮油作物，由大豆疫霉引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一，每年导致全球十几亿美元的直接损失。研究大豆疫霉在侵染大豆过程中效应分子如何激发或抑制植物免疫反应对于揭示病原菌的侵染机制非常重要。大豆疫霉基因组中有将近400个RxLR效应分子。本实验室鉴定到了大豆疫霉无毒基因Avr3b其能够被大豆抗病基因Rps3b识别，并且这类RxLR-Nudix效应分子对植物的全部毒力是必须的。生物信息学分析发现Avr3b编码的蛋白包含Nudix motif，并且其活性在体外得到了证实。本研究证明Avr3b能够在植物细胞水解NAD(P)、NAD(P)H等残基X相连的二磷酸核苷结构，并且能够调节植物细胞内GSH/GSSG的比值。从而进一步阐释了Avr3b在病原菌侵染过程中调节植物免疫的分子机制。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1供试烟草和供试菌株的保存和培养 3
1.2大肠杆菌中提取PVXFLAG::Avr3b、PVXFLAG::GFP质粒3
1.3农杆菌GV3101感受态细胞的制备和转化方法3
1.3.1化学法制备农杆菌感受态3
1.3.2 农杆菌转化3
1.4烟草瞬时表达效应分子Avr3b4
1.5 NAD(P)、NAD(P)H和GSH/GSSG的检测4
1.5.1 NAD(P)、NAD(P)H的提取和测定4
1.5.2 试剂盒检测GSH和GSSG4
1.6目的基因在烟草中瞬时表达蛋白的检测5
1.6.1蛋白电泳及Western blot所用到的试剂5
1.6.2蛋白电泳及Western blot检测5
2结果与分析6
2.1 NAD(H), NADP(H) 是Avr3b的偏好性底物6
2.2 Avr3b影响植物的氧化还原平衡6
2.3 Western blot鉴定FLAGGFP 和FLAGAvr3b在烟草中的表达7
3讨论7
致谢8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
/> 参考文献8
大豆疫霉无毒效应分子Avr3b调节
植物细胞NAD(P)、NAD(P)H水平及氧化还原平衡
引言
大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一[1][2]，每年导致全世界1020亿美元的损失[3]。大豆疫霉是一类营半活体营养的病原卵菌，在侵染寄主初期待营活体营养，成功侵入之后进入死体营养阶段。因此大豆疫霉在侵染过程中必然存在复杂的分子机制来操纵植物的细胞死亡[4]。研究大豆疫霉在侵染大豆过程中效应分子如何激发或抑制植物免疫反应对于揭示病原菌的侵染机制非常重要[5]。
效应分子（effectors）是由病原菌分泌的、通过改变寄主植物细胞结构和代谢途径，从而促进对寄主植物成功侵染的或者触发寄主防卫反应的一类外泌型蛋白分子[6]。目前认为卵菌可以分泌几百个效应分子，分别在寄主植物中有不同的作用位点[6][7]。一类定位于寄主细胞质外体，这类效应分子作用于胞外靶标和膜表面受体，如疫霉属植物病原卵菌分泌抑制寄主植物葡聚糖酶和蛋白酶的抑制因子以抑制植物病程相关蛋白的攻击，此外，许多真核病原菌的无毒基因都编码一些小的（<150aa）包含偶数个半胱氨酸残基的分泌蛋白，形成稳定的二硫桥在植物抗性的诱导以及无毒基因的功能中发挥着重要作用[8][9]；另外一类是能够进入寄主细胞内的效应分子，包括能被植物抗病蛋白识别的无毒蛋白、RxLR效应蛋白和CRN蛋白家族等，CRN1和CRN2类似于细菌效应分子作为效应蛋白干扰寄主细胞代谢，RxLR类效应分子可通过多种途径干扰植物的免疫反应[10]。
植物的免疫系统可分为两个层面[11]，其与病原物的互作可以用 “之”字形模型来进行描述：首先是植物细胞膜上的跨膜识别受体与病程相关分子模式或微生物相关分子模式(Microbial or Pathogen associated Molecular Patterns, PAMPs/MAMPs)作用。微生物中必不可少的保守小分子PAMPs被识别后激发植物基础防卫反应，从而阻碍病原物的进一步扩展，即PAMPTriggered Immunity(PTI)，它包括诱导了MAPK (mitogenactivated protein kinase)级联反应途径、转录因子的激活、活性氧的产生、胼胝质的积累、气孔的关闭等等[5]。而病原物则分泌效应分子来干扰和破坏寄主的PTI反应，增加病原物的毒性，最终导致寄主感病(EffectorTriggered Susceptibility,ETS)。植物也能通过抗病蛋白来对这些效应分子进行识别，产生防卫反应，这种防卫反应被称之为效应分子出发的防卫反应Effectortriggered Immunity (ETI)。ETI是一种加速和强烈的抗病反应，一般表现为在侵染位点出现过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death response, HR)[4]。当然，在强大的自然选择压力的驱动下，病原物和植物在不断的协同进化中，新的效应分子和新的抗病基因以及ETI也在不断产生，而这种植物与病原之间类似于军备竞赛的武器升级也会在共同进化的过程中不断地延续下去[11]。
因为RxLRdEER类蛋白能够进入植物细胞内，推测它们有可能促进了病原菌对于寄主的毒性。尽管已经知道无毒蛋白在含有对应抗病蛋白的植物上引起过敏性细胞死亡，但是对于这些RxLR效应分子在亲和互作中的作用还不清楚。本实验室鉴定到了大豆疫霉无毒基因Avr3b其能够被大豆抗病基因Rps3b识别，能够引起抗病植株的ETI，并且这类RxLRNudix效应分子对植物的全部毒力是必须的，但其毒性功能仍处于研究阶段。
一些Nudix水解酶在植物防御响应中作为负调控因子参与反应[12]，水解残基X相连的二磷酸核苷。Avr3b编码的分泌蛋白包含RxLR寄主靶向基序、C端W结构域和Nudix motif，且生化分析证实Avr3b是一种ADP核糖/NADH焦磷酸化酶，可以模拟植物防卫反应抑制因子的作用干扰植物的抗病性[13]。因而Avr3b可能被递送到宿主细胞作为Nudix水解酶削弱寄主免疫反应来表现毒性功能的[13]。氧化还原态(Redox status)平衡是机体内环境稳定的基本内涵之一, 它影响到基因转录、信号转导, 以及细胞的增殖、分化、凋亡、坏死等许多生理、病理生理过程[14]。谷胱甘肽是广泛分布于植物和微生物细胞内最主要、含量最丰富的含巯基的低分子肽。还原型谷胱甘肽(GSH)是植物体内重要的活性物质，能清除生物体内的自由基，它与氧化型谷胱甘肽(GSSH)形成一对抗氧化剂缓冲液，参与胞内代谢和清除植物遭受氧化胁迫时所产生的过氧化物等重要生理生化过程[15]。本实验将分析在烟草中过表达Avr3b对植物细胞内NAD(P)、NAD(P)H等的水解作用以及细胞内氧化还原平衡的影响，从而进一步阐释Avr3b在病原菌侵染过程中的毒性功能。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1供试烟草和供试菌株的保存和培养 3
1.2大肠杆菌中提取PVXFLAG::Avr3b、PVXFLAG::GFP质粒3
1.3农杆菌GV3101感受态细胞的制备和转化方法3
1.3.1化学法制备农杆菌感受态3
1.3.2 农杆菌转化3
1.4烟草瞬时表达效应分子Avr3b4
1.5 NAD(P)、NAD(P)H和GSH/GSSG的检测4
1.5.1 NAD(P)、NAD(P)H的提取和测定4
1.5.2 试剂盒检测GSH和GSSG4
1.6目的基因在烟草中瞬时表达蛋白的检测5
1.6.1蛋白电泳及Western blot所用到的试剂5
1.6.2蛋白电泳及Western blot检测5
2结果与分析6
2.1 NAD(H), NADP(H) 是Avr3b的偏好性底物6
2.2 Avr3b影响植物的氧化还原平衡6
2.3 Western blot鉴定FLAGGFP 和FLAGAvr3b在烟草中的表达7
3讨论7
致谢8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
/> 参考文献8
大豆疫霉无毒效应分子Avr3b调节
植物细胞NAD(P)、NAD(P)H水平及氧化还原平衡
引言
大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一[1][2]，每年导致全世界1020亿美元的损失[3]。大豆疫霉是一类营半活体营养的病原卵菌，在侵染寄主初期待营活体营养，成功侵入之后进入死体营养阶段。因此大豆疫霉在侵染过程中必然存在复杂的分子机制来操纵植物的细胞死亡[4]。研究大豆疫霉在侵染大豆过程中效应分子如何激发或抑制植物免疫反应对于揭示病原菌的侵染机制非常重要[5]。
效应分子（effectors）是由病原菌分泌的、通过改变寄主植物细胞结构和代谢途径，从而促进对寄主植物成功侵染的或者触发寄主防卫反应的一类外泌型蛋白分子[6]。目前认为卵菌可以分泌几百个效应分子，分别在寄主植物中有不同的作用位点[6][7]。一类定位于寄主细胞质外体，这类效应分子作用于胞外靶标和膜表面受体，如疫霉属植物病原卵菌分泌抑制寄主植物葡聚糖酶和蛋白酶的抑制因子以抑制植物病程相关蛋白的攻击，此外，许多真核病原菌的无毒基因都编码一些小的（<150aa）包含偶数个半胱氨酸残基的分泌蛋白，形成稳定的二硫桥在植物抗性的诱导以及无毒基因的功能中发挥着重要作用[8][9]；另外一类是能够进入寄主细胞内的效应分子，包括能被植物抗病蛋白识别的无毒蛋白、RxLR效应蛋白和CRN蛋白家族等，CRN1和CRN2类似于细菌效应分子作为效应蛋白干扰寄主细胞代谢，RxLR类效应分子可通过多种途径干扰植物的免疫反应[10]。
植物的免疫系统可分为两个层面[11]，其与病原物的互作可以用 “之”字形模型来进行描述：首先是植物细胞膜上的跨膜识别受体与病程相关分子模式或微生物相关分子模式(Microbial or Pathogen associated Molecular Patterns, PAMPs/MAMPs)作用。微生物中必不可少的保守小分子PAMPs被识别后激发植物基础防卫反应，从而阻碍病原物的进一步扩展，即PAMPTriggered Immunity(PTI)，它包括诱导了MAPK (mitogenactivated protein kinase)级联反应途径、转录因子的激活、活性氧的产生、胼胝质的积累、气孔的关闭等等[5]。而病原物则分泌效应分子来干扰和破坏寄主的PTI反应，增加病原物的毒性，最终导致寄主感病(EffectorTriggered Susceptibility,ETS)。植物也能通过抗病蛋白来对这些效应分子进行识别，产生防卫反应，这种防卫反应被称之为效应分子出发的防卫反应Effectortriggered Immunity (ETI)。ETI是一种加速和强烈的抗病反应，一般表现为在侵染位点出现过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death response, HR)[4]。当然，在强大的自然选择压力的驱动下，病原物和植物在不断的协同进化中，新的效应分子和新的抗病基因以及ETI也在不断产生，而这种植物与病原之间类似于军备竞赛的武器升级也会在共同进化的过程中不断地延续下去[11]。
因为RxLRdEER类蛋白能够进入植物细胞内，推测它们有可能促进了病原菌对于寄主的毒性。尽管已经知道无毒蛋白在含有对应抗病蛋白的植物上引起过敏性细胞死亡，但是对于这些RxLR效应分子在亲和互作中的作用还不清楚。本实验室鉴定到了大豆疫霉无毒基因Avr3b其能够被大豆抗病基因Rps3b识别，能够引起抗病植株的ETI，并且这类RxLRNudix效应分子对植物的全部毒力是必须的，但其毒性功能仍处于研究阶段。
一些Nudix水解酶在植物防御响应中作为负调控因子参与反应[12]，水解残基X相连的二磷酸核苷。Avr3b编码的分泌蛋白包含RxLR寄主靶向基序、C端W结构域和Nudix motif，且生化分析证实Avr3b是一种ADP核糖/NADH焦磷酸化酶，可以模拟植物防卫反应抑制因子的作用干扰植物的抗病性[13]。因而Avr3b可能被递送到宿主细胞作为Nudix水解酶削弱寄主免疫反应来表现毒性功能的[13]。氧化还原态(Redox status)平衡是机体内环境稳定的基本内涵之一, 它影响到基因转录、信号转导, 以及细胞的增殖、分化、凋亡、坏死等许多生理、病理生理过程[14]。谷胱甘肽是广泛分布于植物和微生物细胞内最主要、含量最丰富的含巯基的低分子肽。还原型谷胱甘肽(GSH)是植物体内重要的活性物质，能清除生物体内的自由基，它与氧化型谷胱甘肽(GSSH)形成一对抗氧化剂缓冲液，参与胞内代谢和清除植物遭受氧化胁迫时所产生的过氧化物等重要生理生化过程[15]。本实验将分析在烟草中过表达Avr3b对植物细胞内NAD(P)、NAD(P)H等的水解作用以及细胞内氧化还原平衡的影响，从而进一步阐释Avr3b在病原菌侵染过程中的毒性功能。
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