水稻f2群体粒型及株型相关性状的qtl定位
水稻株叶形态和穗粒结构是产量形成的重要农艺性状，解析产量相关农艺性状QTL有利于开展水稻分子辅助育种研究。本研究利用表型差异较大的水稻品种宝大粒和矮格拉建立F2群体，分析株高、叶型、穗型、粒型等性状遗传特征和QTL。结果表明F2群体株高、叶型、穗型、粒型分离现象明显，除粒长无明显超亲现象外，株高、穗型、叶型、粒宽等均存在明显超亲现象，根据分布的连续性推测它们均为多基因控制。QTL检测12个性状指标共定位到22个QTLs，其中第2染色体上qGL2.2和qGW2.1位于相同区间RM13606~A105，qPL2.1和qGL2.3位于相同区间A105~RM1400，qTGW2.1和qDGT2.1位于相同区间RM5427~RM13606，各区间内的不同基因间可能存在连锁。第7染色体上检测到9个QTL,其中qSNP7.1和qNSB7.1相关性较高，反应出存在一因多效QTL。关键字水稻；株高；叶型；粒型；QTL定位QTL Mapping on Grain size and Plant type of Rice Using an F2 populationStudent majoring in Seed science and engineering Yang QinliTutor Wang jianfeiAbstract: Rice plant type and ear kernel structure is important agronomic traits of yield formation, analysis of yield related QTL for agronomic traits contributing to the development of molecular marker assisted breeding of rice.This study using phenotypic differences of rice varieties with larger grains and low Po group established F2 glasgow,analysis of plant height, leaf type, ear type, grain type and other traits genetic characteristi
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cs and QTL. The results showed that F2 plant height, leaf, panicle and grain separation phenomenon is obvious, in addition to grain length without significant transgressive phenomenon outside, plant height, panicle type, leaf type, grain width are super parent phenomenon. According to the continuity of the distribution of speculated that they are controlled by multiple genes.QTL detection of 12 characters index co localizes to 22 QTLs, In the second chromosome qGL2.2 and qGW2.1 are located in same interval RM13606~A105, qPL2.1 and qGL2.3 are located in same interval A105~RM1400, qTGW2.1 and qDGT2.1 are located in same interval RM5427~RM13606, There may be a linkage between the different genes in each region.9 QTL were detected in seventh chromosomes, where qSNP7.1 and qNSB7.1 correlation was higher, the reaction was a result of multi effect QTL.水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界约一半以上的人口以稻米为主食[1]。水稻是我国第一大粮食作物，为我国人民提供了约40％的热量来源[2]。随着我国人口的不断增长以及耕地面积的不断减少，粮食生产仍然面临着巨大的压力。因此，高产育种仍然是水稻育种的主要方向。水稻产量性状在分离群体中呈现连续的正态分布特征，是典型的数量性状。为了解析高产形成因子，需要将产量分解为不同的农艺性状，分别进行QTL，分析它们对产量的贡献。随着水稻分子标记的大量发掘，水稻高密度分子遗传图谱构建越来越方便，大量的水稻产量相关QTLs如株高、叶型、穗型、粒型等被发掘出来。株高是一个重要的农艺性状，在农业生产中，株高对水稻的生产结构及丰产性有着显著影响[3]。近年来，随着分子生物学的发展，国内外研究者都利用分子标记技术（特别是SSR分子标记技术）构建了许多不同类型的遗传群体，将株高基因定位到了染色体比较精细的位置。张志勇等[4]分别利用“广佳”和“明佳”重组自交系群体在2a中共定位了10个影响水稻株高的QTL，分别位于第1、3、5、6、7、8、9、11、12染色体。其中，位于第7染色体的RM481－RM542区间的qPH－7效应最大，能解释48.35％的表型变异。2个群体没有检测到公共的株高QTL位点，说明遗传背景对株高基因的表达具有显著影响。罗炬等[5]利用“D50”和“HB277”构建的重组自交系群体共定位了位于1、2、3、4、6、8染色体影响水稻株高的QTL，其中qPH2和qPH3在不同环境下均被检测到，同时他们将qPH3精细定位到204kb的区间。兴旺等[6]利用“小白粳子”和“空育131”构建的重组自交系在3个地点共定位到10个影响水稻株高的QTL，其中位于第7染色体RM1306－RM1362区间的qPH－7－1在3个环境下稳定表达。叶型主要研究水稻顶三叶的叶长（Flag leaf length，FLL）、叶宽（Flag leaf width，FLW）及叶面积（Flag leaf area, FLAR）。目前在基因及分子方面的研究已经有了很多报道.彭茂名等[7]利用珍汕97和明恢63的RIL群体进行剑叶形态的QTL定位，叶面积QTL定位在第1、6、11和12染色体上。叶长QTL定位在第1、6和11染色体上，叶宽QTL定位在第3和6染色体上，长宽比QTL定位在第1染色体上。肖珂等[8]利用越光（轮回亲本）和Kasalath杂交构建了回交重组自交系（BILs）对剑叶形态中的3个主要性状进行了相关性分析及QTL定位，在第1、3、4和6染色体上定位到8个QTL，贡献率为4.94%-22.07%。穗型多数研究中，穗期和穗弯曲度的基因克隆、生理表型及分子机制研究比较透彻，而对于穗长、穗粒数及一次、二次枝梗的研究报道相对较少。王晓仁等[9]利用桂朝二号诱变得到的Mh-1与正常的T65-sd1进行杂交的，定位得到基因EUI1。这个基因特异性的抑制了顶节间的伸长，Eui RNAi植株倒一节显著伸长，而过量表达植株则会使整株降低，说明EUI可以调节抽穗种倒一节间的GA含量而影响倒一节的节间伸长[10]。Tabuchi等[11]在突变体库中发现一个稀穗突变，该突变导致穗部的花序减少，并且作者发现lax2和lax1表型类似，它们大部分侧生小穗缺乏腋分生组织且营养生长阶段叶腋分生组织数目减少，LAX2编码一个核蛋白，含有植物特异的保守结构域，能与LAX1蛋白互作，一起调控水稻腋生分生组织的形成。粒型主要包括粒长、粒宽、长宽比、粒厚及粒重。目前粒长的初步定位报道较多，定位到的超过100多，水稻的12条染色体均有分布。粒宽QTL也达90个以上, 同样分布在12条染色体上。粒重、长宽比也均分布在12条染色体上[12]。粒厚QTL数量相对较少，主要位于第1和第5染色体上。在第1、第2、第3及第5染色体上定位到的水稻粒形QTL数较多, 分别为29、18、55和48个, 其中第3染色体定位到的控制粒长和长/宽的QTL数较多, 第5染色体定位到控制粒宽和长/宽的QTL数较多[13]。目前已经精细定位并克隆到的粒型基因基因有分别位于第3、2、5和5号染色体上的GS3[14~15] 、GW2[16]、qSW5[17]和GW5 [18]。GS3是一个控制粒长和粒重的主效基因, GW2是一个控制粒宽和粒重的主效基因, qSW5、GW5是控制粒宽的主效基因。林荔辉等[19]用 H359 和 Acc8558 为亲本杂交建立的重组自交系对水稻粒长、粒宽和粒重进行了QTL定位分析，检测到 15 个与粒长有关的QTL、17个与粒宽有关的QTL和16个与粒重有关的 QTL，可分别解释 75.91%、76.20%和81.40%的表型变异。通过分析，我们发现水稻 QTL 定位的研究表现出以下几个特点一，所定位的水稻QTLs的种类基本上已确定，新性状、新种类已难以发现，即，现在http://www.gramene.org/上收录和统计的水稻 QTLs 已非常的齐全，囊括了几乎全部的作物性状；二，易于田间调查或室内考种的农艺性状所定位的 QTLs 数量较多。如株高、抽穗期和分蘖数，所定位的 QTLs 数量相对较多；三，对于一些具有广泛意义的农艺性状所定位的QTLs 相对要多些，如千粒重、粒数、分蘖、抽穗期、单株产量和一些抗病性状等；四，从 QTL 所分成的9个类型来看，与产量相关的一大类定位或检测到的QTLs数量最多，达到 2054 个，占总数的24.74%，这也说明了作物产量依然是众多学者关注的焦点；其次是与植株自然生长能力相关的QTLs数量和与植株的解剖学相关的QTLs 数量分别为1764和1283个，所占比例分别为21.24%和15.45%；而与生物化学有关和与生物压力相关的QTLs 数量最少，分别是167和402个，其所占比例分别为2.01%和4.84%。本研究利用表型差异较大的水稻品种宝大粒/矮格拉进行F2群体的构建，对F2群体的粒型及株型性状进行考察及其QTL定位，并从差异性状上发掘出新的基因位点，为分子辅助育种的发展做好信息的积累。1 材料与方法1.1材料和群体构建选用材料包括宝大粒和矮格拉。宝大粒是大粒高杆的籼稻品种，矮格拉是小粒矮杆粳稻品系，均来自于太湖流域。定位群体的获得利用前辈于2013年8月份用宝大粒与矮格拉杂交所获得F1，2014年自交所获得F2种子，在2015年5月将F2种下所获得180株水稻为群体材料。测量13个主要农艺性状，并进行主效QTL定位分析。1.2方法1.2.1性状考察（1）株高测量主茎茎秆自地面至最高的穗顶部（不包括芒）之间的距离，精确至1cm。（2）剑叶长量取水稻3个主穗的剑叶长度平均值，精确至0.1cm。（3）剑叶宽量取剑叶长，同时量取水稻的剑叶最宽处，精确至0.1cm。在完熟期F2每株取3穗，室内测量以下性状（4）穗长3个主穗的平均长度，精确至0.1cm。（5）一次枝梗和二次枝梗3个主穗的分枝及二次枝梗着生小穗情况。（6）穗粒数3个主穗总粒数的平均值。（7）实粒数3个主穗饱满籽粒的数量。（8）结实率实粒数占总颖花数的百分比，精确至0.1%。（9）粒长种子脱粒风干后，各单株随机取10粒饱满种子，用数字游标卡尺量取籽粒长度，精确至0.01mm。（10）粒宽量取粒长时，同时测量籽粒宽度，精确至0.01mm。（11）粒重（千粒重）取风干种子成熟谷粒100粒，称取百粒重，精度至0.001g，换算成千粒重。（12）籽粒稃毛密度在光照下直接查看颖壳的绒毛，根据密度从大到小分成5，4，3，2，1，0几个等级。1.2.2 水稻DNA叶片提取DNA的提取使用CTAB方法，具体如下磨样剪水稻幼嫩叶片（6cm左右）于2ml的Eppendorf管中，并在管中放入直径4.5mm的钢珠，然后将Eppendorf管放在磨样盒中，用液氮冷冻2-3min，再用组织粉碎仪进行磨样，时间45s左右；加提取液加入650μL的65℃预热的CTAB提取液，重复混匀，在65℃的烘箱放置15min，并每隔5min混一次；加氯仿/异戊醇加入500μL氯仿/异戊醇（24:1），于65℃烘箱放置10min，并每隔5min混一次；离心12000rpm离心8-10min；吸上清吸取上清液到1.5ml的离心管中；并加入500μL的异丙醇，上下颠倒使其混匀，并防止-20℃冰箱静置120min以上；离心12000rpm离心8min，适当降低离心速度和时间亦可；洗涤弃上清，往管中加入500μL预冷的70%乙醇，静置5min；离心12000rpm离心2min，弃乙醇，置于常温或超净台吹干；加入适量的ddH2O或TE缓冲液溶解，-20℃保存。1.2.3 PCR反应体系DNA模板 1μLMixed SSR primer 1μL10Xbuffer(含Mg2+) 1μL dNTP 0.2μLTaq enzyme 0.1μLddH2O 6.7μLTotal 10μL1.2.4 PCR扩增程序94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，35个循环；72℃延伸反应10min；4℃保存。1.2.5 电泳检测PCR产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行检测，银染显色。1.2.5.1 制胶40ml 8%的PAGE配方为28mlddH2O，4ml 10×TBE，8ml 40%的丙烯酰胺母液，40μL TEMED，400μL AP（过硫酸铵）。混匀后将丙烯酰胺凝胶倒入玻璃板夹层中，快速插入梳子，在室温下放置至聚合凝固。其中1L的10×TBE是用108g Tris base 和55g硼酸加入盛有一定蒸馏水的烧杯中，然后加入40ml 0.5M EDTA（pH 8.0），最后用蒸馏水定容至1L；40%聚丙烯酰胺是将380g的丙烯酰胺和20 g亚甲双丙烯酰胺混合，加入蒸馏水定容至1L，然后过滤，4℃保存备用。1.2.5.2 电泳当聚丙烯酰胺凝固后，往电泳槽内加入0.5×TBE缓冲液，中间的缓冲液漫过梳子，然后轻轻拔掉梳子（拔梳子时两端均匀用力，防止用力不均导致胶孔歪斜），在10μLPCR产物加入2μL loading buffer，往胶孔点2.5μL的样，然后在电压200V、电流100mA下电泳1.5小时左右。1.2.5.3 银染根据如下步骤进行银染，按一个槽子，两块PAGE胶的量算固定配制固定液（乙醇10ml，冰醋酸0.5ml，蒸馏水100ml），将电泳结束后的胶置于其中，并在脱色摇床上缓慢摇动5-10min；染色倒去固定液，加入100ml0.2%的硝酸银溶液，在脱色摇床上缓慢摇动15min;漂洗倒去硝酸银溶液，加入0.002%的硫代硫酸钠溶液100ml，30s，倒去硫代硫酸钠，再加入100ml的蒸馏水漂洗；显色加入100ml显色液（甲醛1.5g，NaOH 1.5g，蒸馏水100ml），在脱色摇床上缓慢摇动5-10min；冲洗用清水数次清洗PAGE胶；（6） 读胶将胶置于反射灯箱进行观察。1.2.6 分子标记的选择与鉴定分子标记采用SSR标记，即采用已公开发表的引物(International Rice Microsatellite Initiative, http://www.Gramene.org/microsat/;[18~19]）。SSR标记的鉴定是通过PCR进行扩增，然后用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，读带。1.2.7 连锁图谱的构建及QTL定位相关软件 本实验室引物库已有的引物，从中选取1000对SSR引物对亲本宝大粒与矮格拉多态性进行筛选，选取具有多态，且条带清晰易于区分的引物作为候选引物，用于后续使用，根据Gramene网站marker数据库（http://www.gramene.org/markers/）对标记物理位置的注释查询，最后筛选出100对SSR引物在染色体上分布比较均匀且具有多态性。用100对均匀分布于12条染色体的SSR引物，对其进行表型和标记基因型关联分析，并根据分子标记所显示的基因型，利用QTL定位分析软件IciMapping3.20提供的复合区间遗传图谱构建程序，以LOD=2.5为阈值对标记进行分组，按照染色体标记顺序进行引物排序梳理，构建遗传连锁图。2 实验内容与结果分析 宝大粒属于高杆大粒籼稻品种，矮格拉属于矮杆小粒粳稻品种，其主要农艺性状的对比如下宝大粒株高119.4±0.4cm；穗长29.3±3.7cm；结实率为78%±2%；穗粒数230±10粒；二次枝梗40±4个；一次枝梗15±1个；剑叶宽1.5±0.1cm；剑叶长45.2±1.2cm；千粒重55.8±2.1g，粒长为12.29±0.57mm；粒宽为4.21±0.25mm；籽粒绒毛度5。矮格拉株高65.9±2.9cm；穗长14.2±1.2cm；结实率为91%±1%；穗粒数40±4粒；二次枝梗5±1个；一次枝梗6±1个；剑叶宽0.9±0.1cm；剑叶长20.1±0.4cm；千粒重50.3±1.1g，粒长为7.70±0.13mm；粒宽为3.69±0.11mm；籽粒绒毛度2。以上数据可以看出，两亲本在株高、叶型、穗型和粒型等许多性状上极显著差异，期望通过这两个亲本的配组，在F2分离群体中发掘出新的优良性状位点。亲本表型如图1 图1 亲本宝大粒与矮格拉的基本农艺性状对比Figure 1 Comparison of agronomic traits between BDL and AGL.注A。BDL和AGL株型对比，标尺=50厘米；B。BDL和AGL穗型对比，标尺=5厘米；C。BDL和AGL叶型对比，标尺=5厘米；D,E。BDL和AGL粒型对比，标尺=5厘米Note: A。The comparison of plant height between BDL and AGL,Bar=50cmB。The comparison of panicle between BDL and AGL, Bar=5cmC。The comparison of flag leaf between BDL and AGL, Bar=5cmD and E。The comparison of Grain between BDL and AGL, Bar=5cm2.1宝大粒/矮格拉F2分离群株高的遗传分析 水稻地方品种宝大粒与矮格拉杂交得到F1，F1自交得F2，种植F2群体。结果显示F2群体出现明显的株高分离现象，分离表型成单峰连续分布，初步判断水稻株高是由多个基因共同控制。群体众数偏向于亲本宝大粒，超亲个体主要分布于正向侧，说明影响株高主要QTL来自于宝大粒(图2)。图2 宝大粒/矮格拉与F2分离群体及株高次数分布图Figure 2 Phenotype of BDL/AGL and F2 segregation population and frequency distribution of grain height in F2 segregation populations注A.亲本与F2分离群体株高,bar为50cm; B.F2分离群体株高次数分布图Note: A.the parents and the F2 isolate population plant height, bar is 50cm; B.F2 isolates the high frequency distribution graph2.2宝大粒/矮格拉F2分离群体叶型的遗传分析 亲本宝大粒与矮格拉在叶片大小方面有着明显的差异，宝大粒剑叶长45.2cm，宽1.5cm，而矮格拉剑叶长20.1cm，宽0.9cm(如图3)。F2群体剑叶长度和宽度出现明显的分离，剑叶长变幅14.50~57.6cm，剑叶宽变幅在0.60~2.00cm，次数分布呈非连续分布（如图4），表明该表型受多个位点共同作用，是数量性状控制的结果。大多数个体在剑叶长性状表现上处于中间型，但次数分布结果显示，39个单株出现了剑叶长超出宝大粒的叶长，只有2株比短叶亲本矮格拉要短。剑叶宽度双向超亲的数量不是很多。图3 宝大粒、矮格拉及其F2代表性个体的叶片特征，标尺=10厘米Figure 3 Flag leaf characteristics of BDL，AGL and their F2 individuals，Bar=10cm图4 F2群体剑叶形态次数分布Figure 4 Frequency distribution of flag leaf length and width in F2 segregation population注A.F2群体剑叶长次数分布图；B.F2群体剑叶宽次数分布图Note: ,Frequency distributions of flag length in F2 population. B, Frequency distributions of flag width in F2 population.2.3宝大粒/矮格拉F2群体穗型的遗传分析宝大粒和矮格拉在穗型方面存在明显的差异，亲本宝大粒的穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、穗粒数远超过矮格拉，但小穗亲本矮格拉的结实率较宝大粒高20%左右（图5）。F2分离群体各单株在穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、颖花数和结实率上有明显的差异，表现为连续分布，说明以上5个性状并非单基因控制，属于典型的数量性状。图5 宝大粒、矮格拉及其F2群体穗部特征Figure 5 Panicle traits of BDL，AGL and their F2 individuals群体穗长变幅14.0~39.1cm，大多数个体穗长介于亲本之间，部分个体出现双向超亲，但穗长小于亲本矮格拉的个体就2个，其余均超亲本矮格拉，呈连续分布。一次枝梗数及二次枝梗数的变幅可达2~20和4~51，表型均偏向大穗亲本宝大粒，少数个体出现双向超亲。穗粒数变幅18~271粒/穗，大多数个体穗粒数介于双亲之间，少数个体出现双向超亲现象。F2结实率呈现连续分布，由于是籼粳交群体，F2出现大量结实率较低的个体（图6）。图6 F2群体穗部性状的次数分布Figure.6 Frequency distribution of panicle traits in F2 population注:A.F2群体穗长的次数分布图；B.F2群体一次枝梗的频数次数分布图；C.F2群体二次枝梗的次数分布图；D.F2群体穗粒数的次数分布图；E，F2群体结实率的频数分布直方图；Note: A.Frequency distributions of panicle length in F2 population; B.Frequency distributions of number of second branch in F2 population; C.Frequency distributions of number of second branch in F2 population;; D.Frequency distributions of spikelet grain number in F2 population. E, Frequency distributions of seed setting rate in F2 population2.4 宝大粒/矮格拉F2分离群体粒型的遗传分析 对该群体亲本、F2分离群体的180个株系的谷粒长度、宽度和千粒重的数据进行统计（图7），亲本长宽及千粒重之间具有显著差异，F2群体多数株系表型介于双亲之间，呈连续分布，未出现典型孟德尔遗传分离现象，属于多基因共同控制的数量性状。粒长变幅6.66~12.72mm，没有出现明显的超亲现象；粒宽变幅2.97-4.45mm，出现明显的双向超亲现象，其中30%个体粒宽小于亲本矮格拉；千粒重变幅29.98~64.80g，有明显的双向超亲现象，64%出现千粒重低于亲本矮格拉，5%千粒重高于亲本宝大粒，介于双亲之间的个体只占群体的21%（图8）。 图7 宝大粒、矮格拉及其F2个体的籽粒表型Figure 7 Grain of BDL/AGL and their F2 individuals图8 F2群体籽粒性状的次数分布Figure 8 Frequency distribution of Grain traits in F2 population注A.F2群体粒长次数分布图；B.F2群体粒宽次数分布图；C.F2群体千粒重次数分布图；D..F2群体稃毛密度次数分布图Note:A.Frequency distributions of grain length in F2 population; B.Frequency distributions of grain width in F2 population; C. Frequency distributions of thousand grain weight in F2 population;D, Frequency distributions of density of grain tomentum in F2 population2.5 水稻性状QTL定位2.5.1 株高QTL定位分离群体中共发现2个主效株高QTL位点，分别位于第1和第7染色体。第1染色体上的主效QTL位点qPH1.1位于Y9~RM3602之间，LOD值为12.1，表型贡献率为16.76%，加性效应-12.53，说明该增效位点来自矮杆亲本矮格拉；第7染色体上的株高主效QTL位点qGH7.1位于RM524~A83之间，LOD值为23.3，表型贡献率33.84%，加性效应18.48，说明该增效位点来自亲本宝大粒（图9，表1）。图9 F2群体中定位的株高QTLFigur 9 Mapping of QTL for plant height in F2 populations表1 F2群体中定位到的株高QTL数据统计表Table 1 Date collection of the QTL for plant length in F2 popualtion基因名称Gene Name染色体Chromosome左标记Left Marker右标记Right MarkerLOD值LOD贡献率PVE(%)加性效应Add显性效应DomqPH1.11Y9RM360212.101516.7561-12.52632.5647qGH7.17RM542A8323.345433.842918.48264.77142.5.2 叶型QTL定位群体中检测到4个剑叶长度QTL，分别在第2、第7和第10染色体上，LOD范围在3.86~10.02。剑叶长度QTL qFLL2.1，位于第2染色体的SSR标记RM6639~RM6374之间，LOD值仅为3.86，对表型的贡献率是6.48%，加性效应值为3.61，增效位点来自亲本宝大粒。qFLL7.1位于第7染色体标记A80~A88之间，LOD值为10.02，表型贡献率为18.22%，加性效应值为6.33，为效应值最大的剑叶长度QTL,其增效位点来自亲本宝大粒。qFLL7.2位于第7染色体标记A28~RM3826之间，LOD值4.05，表型贡献率7.03，加性效应值为-0.33，增效位点来自矮格拉，其效应很小。qFLL10.1定位于第10染色体上标记A61~RM7217之间，对表型贡献率为8.65%，加性效应为-4.26，增效来自于亲本矮格拉（图10,表2）。群体中仅检测到1个剑叶宽度QTL qFLW7.1，位于第7染色体上标记RM542~A83之间，LOD值为6.63，对表型贡献率为14.82，加性效应为0.16，该增效位点来自亲本宝大粒。 图10 F2群体中定位的剑叶长及剑叶宽QTLFigure 10 Mapping of QTL for Flag leaf length and width in F2 populations表2 F2群体中定位到的剑叶长和剑叶宽QTLs数据统计表Table 2 Date collection of the QTLs for Flag leaf length and width in F2 popualtion基因名称Gene Name染色体Chromosome左标记Left Marker右标记Right MarkerLOD值LOD贡献率PVE(%)加性效应Add显性效应DomqFLL2.12RM6639RM63743.86 6.48 3.61 -1.71 qFLL7.17A80A88 10.02 18.22 6.33 0.92 qFLL7.27A28RM38264.05 7.03 -0.33 5.37 qFLL10.110A61RM72173.92 8.65 -4.26 0.50 qFLW7.17RM542A836.63 14.82 0.16 0.03 2.5.3 穗型QTL定位 对穗长、一次支梗数、二次支梗数、穗粒数和结实率5个穗部性状进行QTL定位。检测到2个穗长QTL，即qPL2.1位于第2染色体的A105~RM14001之间，LOD值为7.19，表型贡献率为12.35%，加性效应值为2.33；qPL7.1第7染色体的标记A88~A93之间，LOD值为20.05，表型贡献率为29.20%，加性效应值为3.93，增效均来自于亲本宝大粒。检测到1个穗粒数QTL，即 qNP7.1位于第7染色体A93~A82区间，LOD值为10.98，表型贡献率24.57%，加性效应值为33.86，增效来自亲本宝大粒。检测到一次支梗数和二次枝梗数QTL各1个，即qNPB7.1和qNSB7.1，它们分别位于第7染色体标记A93~A82和A88~A93之间，LOD值为7.18和24.15，表型贡献率为17.17%和24.15%。检测到1个结实率QTL qSSR6.1，位于第6染色体W45~Y48之间，LOD值为6.79，表型贡献率为20.97%，加性效应值为-0.0266，增效来自亲本矮格拉（图11,表3）。图11 穗部性状QTL定位结果Figur 11 Mapping of QTL for panicle traits in F2 population表3 F2群体中定位到穗部性状QTLs数据统计表Table 3 Date collection of the QTLs for panicle traits in F2 popualtion基因名称Gene Name染色体Chromosome左标记Left Marker右标记Right MarkerLOD值LOD贡献率PVE(%)加性效应Add显性效应DomqPL2.12A105RM140017.1912.352.39-0.80qPL7.17A88A9320.0529.203.931.10qSNP7.17A93A8210.9824.5733.8612.70qNPB7.17A93A827.1817.171.760.63qNSB7.17A88A9311.0324.156.672.55qSSR6.16W45Y486.7920.97-0.03-0.162.5.4粒型QTL定位在第2、第3和第10染色体定位到4个粒长QTL位点。粒长qGL2.2，位于第2染色体SSR标记RM13606~A105之间，LOD值为10.36，对表型的贡献为22.86%，加性效应值为0.79，增效位点来自亲本宝大粒。粒长qGL2.3，位于在第2染色体SSR标记A105~RM14001之间，LOD值为12.08，对表型贡献率为26.22%，加性效应值为0.86，增效来自亲本宝大粒。粒长 qGL3.3位点，位于第3染色体SSR标记W30~W31之间，LOD值为5.10，对表型贡献率为7.67%，加性效应值为0.49，增效来自于亲本宝大粒。粒长qGL10.1，位于第10染色体标记Y77~W7之间，LOD值为3.85，表型贡献率为5.25%，加性效应为0.41，增效位点来自于亲本宝大粒。在第2和第7染色体上定位到2个粒宽QTL位点。粒宽qGW2.2，位于第2染色体SSR标记RM13606~A105之间，LOD值为8.04，表型贡献率为26.92%，加性效应为0.20，增效来自亲本宝大粒。粒宽qGW7.3，位于第7染色体SSR标记A85~A28之间，LOD值为4.92，表型贡献率为10.32%，加性效应值为0.18，增效来自于亲本宝大粒。在第2染色体定位到2个千粒重QTL位点。qTGW2.1和qTGW2.2，位于第2染色体SSR标记RM5427~RM13606和RM14001~A14之间，LOD值为5.96和8.60，表型贡献率为14.44%和19.72%，加性效应为4.34和4.99，增效均来自于亲本宝大粒。稃毛密度只有定位到一个位点，qDGT2.1位于SSR标记RM13606~A105之间，LOD值为4.66表型贡献率为11.47%，加性效应为0.49，增效来自于亲本宝大粒（图12，表4）。图12 F2群体粒长、粒宽、千粒重及籽粒绒毛度遗传图Figure. 12 The location of grain length, grain width, thousand grain weight and tomentum rate of grain in F2 populations表4 F2群体中定位到粒型性状QTLs数据统计表Table 4 Statistical table of QTLs data in F2 population for orientation to grain type traits基因名称Gene Name染色体Chromosome左标记Left Marker右标记Right MarkerLOD值LOD贡献率PVE(%)加性效应Add显性效应DomqGL2.22RM13606A10510.36 22.86 0.79 0.00 qGL2.32A105RM1400112.08 26.22 0.86 -0.02 qGL3.33W30W315.10 7.67 0.49 0.09 qGL10.110Y77W73.85 5.25 0.41 -0.05 qGW2.22RM13606A1058.04 26.92 0.20 -0.02 qGW7.37A85A284.92 10.32 0.13 -0.02 qTGW2.12RM5427RM136065.96 14.44 4.34 1.74 qTGW2.22RM14001A148.60 19.72 4.98 2.40 qDGT2.12RM13606A1054.66 11.47 0.49 0.44 3讨论3.1 结论与讨论 水稻的主要农艺性状与水稻高产有着直接关系，深入了解水稻主要农艺性状的基因位点对水稻育种起到重要作用。目前世界上对主要农艺性状的QTL定位有很多，且12条染色体上均有分布。 在第2染色体标记RM13606~A105之间检测到qGL2.2和qGW2.1，这 2个QTL位点遗传距离为1cm，相关性较高，推测在这个位点存在一个多效基因，同时控制粒长和粒宽。在第2染色体标记A105~RM14001之间检测出qPL2.1和qGL2.3，这2个QTL位点相距3cm，其相关性较高，2位点之间可能存在连锁。在第2染色体上标记RM5427~RM13606之间检测出来qTGW2.1和qDGT2.1，这2个QTL位点距离相近，可能存在连锁关系。 在第7染色体A80~RM3826之间的12cm内检测到9个QTL位点，qFLL7.1位于33cm位置，qPL7.1和qNSB7.1位于34cm位置，qNPB7.1位于36cM，qSNP7.1位于37cm，qPH7.1位于38cm，qFLW7.1位于40cm，qGW7.3位于43cm，qFLL7.2位于46cm。qGW7.3与qFLW7.1不存在相关性，说明2位点独立遗传，与qPH7.1相关性性较低。qPL7.1与其他8个位点都存在极显著正相关，其中与qFLW7.1位点相关性最小，与qSNP7.1相关性最高。qSNP7.1和qNSB7.1相关性较高，说明这2个QTL存在紧密连锁或是一因多效，与其他位点相关性系数也在45%以上。其他各位点之间也存在这极显著的相关性，具体是否有连锁关系还要进一步验证。 在第2和第7染色体上出现基因聚集的现象，在第2染色体上检测到粒长、粒宽、千粒重、稃毛密度和穗长这些QTL位点，在第7染色体检测到，剑叶长宽、一次和二次枝梗数、穗粒数、穗长、株高和粒宽QTL位点。F2群体在第1和第7染色体上定位到了株高的主效QTL位点。在第1染色体上qPH1.1所在区域已有sd-1和THIS1存在，本研究发现该位点的增效作用来自矮格拉，推断宝大粒中携带隐性半矮杆基因sd-1，而矮格拉中则携带高杆SD-1等位基因。引起矮格拉矮秆的唯一主效位点是位于第7染色体上的另一个控制株高的位点qPH7.1，其增效位点来自宝大粒，矮秆效应来自矮格拉，且该位点尚未被报道。F2群体中qGW2.3、qGL2.2在同一位点，位于着丝粒下方，与2015年报道的控制粒长、粒宽和长宽比的多效基因GS2处于同一位置，且GS2也是用宝大粒来构建的BDLNIL群体进行定位，并且增效位点来自宝大粒。qPL2.1、qPL7.1、qSSR6.1、qNPB7.1、qNPB7.2、qNSB7.1、qFLL7.2、qFLL7.3、qFLW7.1和qDGT2.1这些位点尚未被报道，有待进一步研究。3.2 前景与展望依靠日趋饱和的分子遗传图谱和日益完善的QTL定位方法,近年来对作物QTL 的研究发展很快,目前在许多作物中都已经进行了产量性状的QTL定位。虽然同时也存在许多问题，如当前分子标记辅助的QTL定位只能是初级定位，大多数分子标记定位的 QTL的位置、效应随实验材料、时间和地点而异，而且成本较高等。但是，随着分子生物学技术的发展、数量遗传学研究的不断深入、更高密度遗传图谱的构建、QTL的位置、效应和机理的逐步探明，以及成本较低的基于PCR 的分子标记技术的发展和应用，水稻主要农艺性状QTL定位将在作物的高产和超高产育种中发挥巨大的作用。未来的研究可以多挖掘新的基因位点，对基因位点进行精确定位，通过对基因克隆与转接实现水稻高产育种的目标。致谢本课题与硕士研究生张栩共同实施完成的，在此特表感谢，同时得到武浩、杨彬师兄和尚菲、连光倩、翟雪师姐的鼎力支持，他们中很多人直接协助和参与了田间试验工作，付出了许多辛勤的劳动，在此一并表示衷心的感谢！感谢大学为我们提供的良好学习环境，感谢作物遗传与育种国家重点实验室为我提供课题和完善的实验室条件。衷心地感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授！最后，谨向我的家人和好朋友致以最深切的谢意，感谢你们这四年来对我的理解、关怀和鼓励。参考文献[1] Delseny M,Salses J,Cooke R Rice genomices.Present and future ,2001(1).[2] 左科生,李育,钟平安.水稻理想株型与超高产育种的研究进展[J] .江西农业学报, 2003(1).[3] 孙旭初. "水稻茎秆抗倒性的研究"[J] .中国农业科学，987，20(4): 32-37.[4] 张志勇,黄育民,张凯,等.水稻株高QTL分析及精确性分析[J].厦门大学学报(自然科学版),2008,47(1):116-124.[5] 罗炬，邵高能，魏祥进，等．一个控制水稻株高QTLqPH3的遗传分析[J]．中国水稻科学，2012，26(4):417~422.[6] 兴旺，赵宏伟，王江旭，等．多环境下水稻株高QTL定位研究[J]．东北农业大学学报，2014,45(8):1~5.[7] 彭茂名, 杨国华, 张菁晶, 安保光,李阳生. 不同遗传背景下水稻剑叶形态性状的QTL分析[J]. 中国水稻科学, 2007,21(3): 247-252.[8] 肖珂, 左海龙, 巩迎军, 张俊志, 张永娟,董彦君.控制水稻剑叶形态相关性状的数量基因位点(QTL)的定位[N]. 上海师范大学学报（自然科学版）,2007-36-2.[9] 王仁晓, 李培金,等. Fine localization of rice EUI 1gene controlling elongation of the uppermost internode[J]. 遗传学报,2005,32(9): 955-959.[10] Zhang, Y. Y., Y. Y. Zhu, Y. Peng, D. Yan, Q. Li, J. Wang, L. Y. Wang and Z. H. He . Gibberellin homeostasis and plant height control by EUI and a role for gibberellin in root gravity responses in rice[J].Cell Research ,2008,18(3): 412-421.[11] Tabuchi, H., Y. Zhang, S. Hattori, M. Omae, S. Shimizu-Sato, T. Oikawa, Q. Qian, M. Nishimura, H. Kitano, H. Xie, X. Fang, H. Yoshida, J. Kyozuka, F. Chen and Y. Sato . LAX PANICLE2 of rice encodes a novel nuclear protein and regulates the formation of axillary meristems[J]. Plant Cell ,2011,23(9): 3276-3287.[12] 宫李辉, 高振宇, 马伯军, 钱前.水稻粒形遗传的研究进展[J].植物报,2011,46:(6),597–605.[13] 高志强, 占小登, 梁永书, 程式华, 曹立勇.水稻粒形性状的遗传及相关基因定位与克隆研究进展[J].HEREDITAS (Beijing) ,2011,33(4): 314―321 .[14] Fan CC, Xing YZ, Mao HL, Lu TT, Han B, Xu CG, Li XH,Zhang QF . GS3, a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice, encodes a putative transmembrane protein[J]. Theor Appl Genet,2006, 112:1164–1171.[15]Mao HL, Sun SY, Yao JL, Wang CR, Yu SB, Xu CG, Li XH,Zhang QF . Linking differential domain functions of the GS3 protein to natural variation of grain size in rice[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2010,107:19579–19584.[16]Song XJ, Huang W, Shi M, Zhu MZ, Lin HX . A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase[J]. 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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料和群体构建 3
1.2 方法 3
1.2.1 性状考察3
1.2.2 水稻DNA叶片提取3
1.2.3 PCR反应体系4
1.2.4 PCR扩增测序4
1.2.5 电泳测序 4
1.2.6 分子标记与选择鉴定5
1.2.7 连锁图谱的构建及QTL定位相关软件5
2 实验内容与结果分析5
2.1 宝大粒/矮格拉F2分离群体株高遗传分析6
2.2 宝大粒/矮格拉F2分离群体叶型遗传分析6
2.3 宝大粒/矮格拉F2分离群体穗型遗传分析7
4 宝大粒/矮格拉F2分离群体粒型遗传分析8
2.5 水稻性状QTL定位9
2.5.1 株高QTL定位9
2.5.2 叶型QTL定位10
2.5.3 穗型QTL定位11
2.5.4 粒型QTL定位12
3 讨论12
3.1 讨论与结论12
3.2 前景与展望13
致谢13
参考文献14
水稻F2群体粒型及株型相关性状的QTL定位
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
cs and QTL. The results showed that F2 plant height, leaf, panicle and grain separation phenomenon is obvious, in addition to grain length without significant transgressive phenomenon outside, plant height, panicle type, leaf type, grain width are super parent phenomenon. According to the continuity of the distribution of speculated that they are controlled by multiple genes.QTL detection of 12 characters index co localizes to 22 QTLs, In the second chromosome qGL2.2 and qGW2.1 are located in same interval RM13606~A105, qPL2.1 and qGL2.3 are located in same interval A105~RM1400, qTGW2.1 and qDGT2.1 are located in same interval RM5427~RM13606, There may be a linkage between the different genes in each region.9 QTL were detected in seventh chromosomes, where qSNP7.1 and qNSB7.1 correlation was higher, the reaction was a result of multi effect QTL.水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界约一半以上的人口以稻米为主食[1]。水稻是我国第一大粮食作物，为我国人民提供了约40％的热量来源[2]。随着我国人口的不断增长以及耕地面积的不断减少，粮食生产仍然面临着巨大的压力。因此，高产育种仍然是水稻育种的主要方向。水稻产量性状在分离群体中呈现连续的正态分布特征，是典型的数量性状。为了解析高产形成因子，需要将产量分解为不同的农艺性状，分别进行QTL，分析它们对产量的贡献。随着水稻分子标记的大量发掘，水稻高密度分子遗传图谱构建越来越方便，大量的水稻产量相关QTLs如株高、叶型、穗型、粒型等被发掘出来。株高是一个重要的农艺性状，在农业生产中，株高对水稻的生产结构及丰产性有着显著影响[3]。近年来，随着分子生物学的发展，国内外研究者都利用分子标记技术（特别是SSR分子标记技术）构建了许多不同类型的遗传群体，将株高基因定位到了染色体比较精细的位置。张志勇等[4]分别利用“广佳”和“明佳”重组自交系群体在2a中共定位了10个影响水稻株高的QTL，分别位于第1、3、5、6、7、8、9、11、12染色体。其中，位于第7染色体的RM481－RM542区间的qPH－7效应最大，能解释48.35％的表型变异。2个群体没有检测到公共的株高QTL位点，说明遗传背景对株高基因的表达具有显著影响。罗炬等[5]利用“D50”和“HB277”构建的重组自交系群体共定位了位于1、2、3、4、6、8染色体影响水稻株高的QTL，其中qPH2和qPH3在不同环境下均被检测到，同时他们将qPH3精细定位到204kb的区间。兴旺等[6]利用“小白粳子”和“空育131”构建的重组自交系在3个地点共定位到10个影响水稻株高的QTL，其中位于第7染色体RM1306－RM1362区间的qPH－7－1在3个环境下稳定表达。叶型主要研究水稻顶三叶的叶长（Flag leaf length，FLL）、叶宽（Flag leaf width，FLW）及叶面积（Flag leaf area, FLAR）。目前在基因及分子方面的研究已经有了很多报道.彭茂名等[7]利用珍汕97和明恢63的RIL群体进行剑叶形态的QTL定位，叶面积QTL定位在第1、6、11和12染色体上。叶长QTL定位在第1、6和11染色体上，叶宽QTL定位在第3和6染色体上，长宽比QTL定位在第1染色体上。肖珂等[8]利用越光（轮回亲本）和Kasalath杂交构建了回交重组自交系（BILs）对剑叶形态中的3个主要性状进行了相关性分析及QTL定位，在第1、3、4和6染色体上定位到8个QTL，贡献率为4.94%-22.07%。穗型多数研究中，穗期和穗弯曲度的基因克隆、生理表型及分子机制研究比较透彻，而对于穗长、穗粒数及一次、二次枝梗的研究报道相对较少。王晓仁等[9]利用桂朝二号诱变得到的Mh-1与正常的T65-sd1进行杂交的，定位得到基因EUI1。这个基因特异性的抑制了顶节间的伸长，Eui RNAi植株倒一节显著伸长，而过量表达植株则会使整株降低，说明EUI可以调节抽穗种倒一节间的GA含量而影响倒一节的节间伸长[10]。Tabuchi等[11]在突变体库中发现一个稀穗突变，该突变导致穗部的花序减少，并且作者发现lax2和lax1表型类似，它们大部分侧生小穗缺乏腋分生组织且营养生长阶段叶腋分生组织数目减少，LAX2编码一个核蛋白，含有植物特异的保守结构域，能与LAX1蛋白互作，一起调控水稻腋生分生组织的形成。粒型主要包括粒长、粒宽、长宽比、粒厚及粒重。目前粒长的初步定位报道较多，定位到的超过100多，水稻的12条染色体均有分布。粒宽QTL也达90个以上, 同样分布在12条染色体上。粒重、长宽比也均分布在12条染色体上[12]。粒厚QTL数量相对较少，主要位于第1和第5染色体上。在第1、第2、第3及第5染色体上定位到的水稻粒形QTL数较多, 分别为29、18、55和48个, 其中第3染色体定位到的控制粒长和长/宽的QTL数较多, 第5染色体定位到控制粒宽和长/宽的QTL数较多[13]。目前已经精细定位并克隆到的粒型基因基因有分别位于第3、2、5和5号染色体上的GS3[14~15] 、GW2[16]、qSW5[17]和GW5 [18]。GS3是一个控制粒长和粒重的主效基因, GW2是一个控制粒宽和粒重的主效基因, qSW5、GW5是控制粒宽的主效基因。林荔辉等[19]用 H359 和 Acc8558 为亲本杂交建立的重组自交系对水稻粒长、粒宽和粒重进行了QTL定位分析，检测到 15 个与粒长有关的QTL、17个与粒宽有关的QTL和16个与粒重有关的 QTL，可分别解释 75.91%、76.20%和81.40%的表型变异。通过分析，我们发现水稻 QTL 定位的研究表现出以下几个特点一，所定位的水稻QTLs的种类基本上已确定，新性状、新种类已难以发现，即，现在http://www.gramene.org/上收录和统计的水稻 QTLs 已非常的齐全，囊括了几乎全部的作物性状；二，易于田间调查或室内考种的农艺性状所定位的 QTLs 数量较多。如株高、抽穗期和分蘖数，所定位的 QTLs 数量相对较多；三，对于一些具有广泛意义的农艺性状所定位的QTLs 相对要多些，如千粒重、粒数、分蘖、抽穗期、单株产量和一些抗病性状等；四，从 QTL 所分成的9个类型来看，与产量相关的一大类定位或检测到的QTLs数量最多，达到 2054 个，占总数的24.74%，这也说明了作物产量依然是众多学者关注的焦点；其次是与植株自然生长能力相关的QTLs数量和与植株的解剖学相关的QTLs 数量分别为1764和1283个，所占比例分别为21.24%和15.45%；而与生物化学有关和与生物压力相关的QTLs 数量最少，分别是167和402个，其所占比例分别为2.01%和4.84%。本研究利用表型差异较大的水稻品种宝大粒/矮格拉进行F2群体的构建，对F2群体的粒型及株型性状进行考察及其QTL定位，并从差异性状上发掘出新的基因位点，为分子辅助育种的发展做好信息的积累。1 材料与方法1.1材料和群体构建选用材料包括宝大粒和矮格拉。宝大粒是大粒高杆的籼稻品种，矮格拉是小粒矮杆粳稻品系，均来自于太湖流域。定位群体的获得利用前辈于2013年8月份用宝大粒与矮格拉杂交所获得F1，2014年自交所获得F2种子，在2015年5月将F2种下所获得180株水稻为群体材料。测量13个主要农艺性状，并进行主效QTL定位分析。1.2方法1.2.1性状考察（1）株高测量主茎茎秆自地面至最高的穗顶部（不包括芒）之间的距离，精确至1cm。（2）剑叶长量取水稻3个主穗的剑叶长度平均值，精确至0.1cm。（3）剑叶宽量取剑叶长，同时量取水稻的剑叶最宽处，精确至0.1cm。在完熟期F2每株取3穗，室内测量以下性状（4）穗长3个主穗的平均长度，精确至0.1cm。（5）一次枝梗和二次枝梗3个主穗的分枝及二次枝梗着生小穗情况。（6）穗粒数3个主穗总粒数的平均值。（7）实粒数3个主穗饱满籽粒的数量。（8）结实率实粒数占总颖花数的百分比，精确至0.1%。（9）粒长种子脱粒风干后，各单株随机取10粒饱满种子，用数字游标卡尺量取籽粒长度，精确至0.01mm。（10）粒宽量取粒长时，同时测量籽粒宽度，精确至0.01mm。（11）粒重（千粒重）取风干种子成熟谷粒100粒，称取百粒重，精度至0.001g，换算成千粒重。（12）籽粒稃毛密度在光照下直接查看颖壳的绒毛，根据密度从大到小分成5，4，3，2，1，0几个等级。1.2.2 水稻DNA叶片提取DNA的提取使用CTAB方法，具体如下磨样剪水稻幼嫩叶片（6cm左右）于2ml的Eppendorf管中，并在管中放入直径4.5mm的钢珠，然后将Eppendorf管放在磨样盒中，用液氮冷冻2-3min，再用组织粉碎仪进行磨样，时间45s左右；加提取液加入650μL的65℃预热的CTAB提取液，重复混匀，在65℃的烘箱放置15min，并每隔5min混一次；加氯仿/异戊醇加入500μL氯仿/异戊醇（24:1），于65℃烘箱放置10min，并每隔5min混一次；离心12000rpm离心8-10min；吸上清吸取上清液到1.5ml的离心管中；并加入500μL的异丙醇，上下颠倒使其混匀，并防止-20℃冰箱静置120min以上；离心12000rpm离心8min，适当降低离心速度和时间亦可；洗涤弃上清，往管中加入500μL预冷的70%乙醇，静置5min；离心12000rpm离心2min，弃乙醇，置于常温或超净台吹干；加入适量的ddH2O或TE缓冲液溶解，-20℃保存。1.2.3 PCR反应体系DNA模板 1μLMixed SSR primer 1μL10Xbuffer(含Mg2+) 1μL dNTP 0.2μLTaq enzyme 0.1μLddH2O 6.7μLTotal 10μL1.2.4 PCR扩增程序94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，35个循环；72℃延伸反应10min；4℃保存。1.2.5 电泳检测PCR产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行检测，银染显色。1.2.5.1 制胶40ml 8%的PAGE配方为28mlddH2O，4ml 10×TBE，8ml 40%的丙烯酰胺母液，40μL TEMED，400μL AP（过硫酸铵）。混匀后将丙烯酰胺凝胶倒入玻璃板夹层中，快速插入梳子，在室温下放置至聚合凝固。其中1L的10×TBE是用108g Tris base 和55g硼酸加入盛有一定蒸馏水的烧杯中，然后加入40ml 0.5M EDTA（pH 8.0），最后用蒸馏水定容至1L；40%聚丙烯酰胺是将380g的丙烯酰胺和20 g亚甲双丙烯酰胺混合，加入蒸馏水定容至1L，然后过滤，4℃保存备用。1.2.5.2 电泳当聚丙烯酰胺凝固后，往电泳槽内加入0.5×TBE缓冲液，中间的缓冲液漫过梳子，然后轻轻拔掉梳子（拔梳子时两端均匀用力，防止用力不均导致胶孔歪斜），在10μLPCR产物加入2μL loading buffer，往胶孔点2.5μL的样，然后在电压200V、电流100mA下电泳1.5小时左右。1.2.5.3 银染根据如下步骤进行银染，按一个槽子，两块PAGE胶的量算固定配制固定液（乙醇10ml，冰醋酸0.5ml，蒸馏水100ml），将电泳结束后的胶置于其中，并在脱色摇床上缓慢摇动5-10min；染色倒去固定液，加入100ml0.2%的硝酸银溶液，在脱色摇床上缓慢摇动15min;漂洗倒去硝酸银溶液，加入0.002%的硫代硫酸钠溶液100ml，30s，倒去硫代硫酸钠，再加入100ml的蒸馏水漂洗；显色加入100ml显色液（甲醛1.5g，NaOH 1.5g，蒸馏水100ml），在脱色摇床上缓慢摇动5-10min；冲洗用清水数次清洗PAGE胶；（6） 读胶将胶置于反射灯箱进行观察。1.2.6 分子标记的选择与鉴定分子标记采用SSR标记，即采用已公开发表的引物(International Rice Microsatellite Initiative, http://www.Gramene.org/microsat/;[18~19]）。SSR标记的鉴定是通过PCR进行扩增，然后用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，读带。1.2.7 连锁图谱的构建及QTL定位相关软件 本实验室引物库已有的引物，从中选取1000对SSR引物对亲本宝大粒与矮格拉多态性进行筛选，选取具有多态，且条带清晰易于区分的引物作为候选引物，用于后续使用，根据Gramene网站marker数据库（http://www.gramene.org/markers/）对标记物理位置的注释查询，最后筛选出100对SSR引物在染色体上分布比较均匀且具有多态性。用100对均匀分布于12条染色体的SSR引物，对其进行表型和标记基因型关联分析，并根据分子标记所显示的基因型，利用QTL定位分析软件IciMapping3.20提供的复合区间遗传图谱构建程序，以LOD=2.5为阈值对标记进行分组，按照染色体标记顺序进行引物排序梳理，构建遗传连锁图。2 实验内容与结果分析 宝大粒属于高杆大粒籼稻品种，矮格拉属于矮杆小粒粳稻品种，其主要农艺性状的对比如下宝大粒株高119.4±0.4cm；穗长29.3±3.7cm；结实率为78%±2%；穗粒数230±10粒；二次枝梗40±4个；一次枝梗15±1个；剑叶宽1.5±0.1cm；剑叶长45.2±1.2cm；千粒重55.8±2.1g，粒长为12.29±0.57mm；粒宽为4.21±0.25mm；籽粒绒毛度5。矮格拉株高65.9±2.9cm；穗长14.2±1.2cm；结实率为91%±1%；穗粒数40±4粒；二次枝梗5±1个；一次枝梗6±1个；剑叶宽0.9±0.1cm；剑叶长20.1±0.4cm；千粒重50.3±1.1g，粒长为7.70±0.13mm；粒宽为3.69±0.11mm；籽粒绒毛度2。以上数据可以看出，两亲本在株高、叶型、穗型和粒型等许多性状上极显著差异，期望通过这两个亲本的配组，在F2分离群体中发掘出新的优良性状位点。亲本表型如图1 图1 亲本宝大粒与矮格拉的基本农艺性状对比Figure 1 Comparison of agronomic traits between BDL and AGL.注A。BDL和AGL株型对比，标尺=50厘米；B。BDL和AGL穗型对比，标尺=5厘米；C。BDL和AGL叶型对比，标尺=5厘米；D,E。BDL和AGL粒型对比，标尺=5厘米Note: A。The comparison of plant height between BDL and AGL,Bar=50cmB。The comparison of panicle between BDL and AGL, Bar=5cmC。The comparison of flag leaf between BDL and AGL, Bar=5cmD and E。The comparison of Grain between BDL and AGL, Bar=5cm2.1宝大粒/矮格拉F2分离群株高的遗传分析 水稻地方品种宝大粒与矮格拉杂交得到F1，F1自交得F2，种植F2群体。结果显示F2群体出现明显的株高分离现象，分离表型成单峰连续分布，初步判断水稻株高是由多个基因共同控制。群体众数偏向于亲本宝大粒，超亲个体主要分布于正向侧，说明影响株高主要QTL来自于宝大粒(图2)。图2 宝大粒/矮格拉与F2分离群体及株高次数分布图Figure 2 Phenotype of BDL/AGL and F2 segregation population and frequency distribution of grain height in F2 segregation populations注A.亲本与F2分离群体株高,bar为50cm; B.F2分离群体株高次数分布图Note: A.the parents and the F2 isolate population plant height, bar is 50cm; B.F2 isolates the high frequency distribution graph2.2宝大粒/矮格拉F2分离群体叶型的遗传分析 亲本宝大粒与矮格拉在叶片大小方面有着明显的差异，宝大粒剑叶长45.2cm，宽1.5cm，而矮格拉剑叶长20.1cm，宽0.9cm(如图3)。F2群体剑叶长度和宽度出现明显的分离，剑叶长变幅14.50~57.6cm，剑叶宽变幅在0.60~2.00cm，次数分布呈非连续分布（如图4），表明该表型受多个位点共同作用，是数量性状控制的结果。大多数个体在剑叶长性状表现上处于中间型，但次数分布结果显示，39个单株出现了剑叶长超出宝大粒的叶长，只有2株比短叶亲本矮格拉要短。剑叶宽度双向超亲的数量不是很多。图3 宝大粒、矮格拉及其F2代表性个体的叶片特征，标尺=10厘米Figure 3 Flag leaf characteristics of BDL，AGL and their F2 individuals，Bar=10cm图4 F2群体剑叶形态次数分布Figure 4 Frequency distribution of flag leaf length and width in F2 segregation population注A.F2群体剑叶长次数分布图；B.F2群体剑叶宽次数分布图Note: ,Frequency distributions of flag length in F2 population. B, Frequency distributions of flag width in F2 population.2.3宝大粒/矮格拉F2群体穗型的遗传分析宝大粒和矮格拉在穗型方面存在明显的差异，亲本宝大粒的穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、穗粒数远超过矮格拉，但小穗亲本矮格拉的结实率较宝大粒高20%左右（图5）。F2分离群体各单株在穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、颖花数和结实率上有明显的差异，表现为连续分布，说明以上5个性状并非单基因控制，属于典型的数量性状。图5 宝大粒、矮格拉及其F2群体穗部特征Figure 5 Panicle traits of BDL，AGL and their F2 individuals群体穗长变幅14.0~39.1cm，大多数个体穗长介于亲本之间，部分个体出现双向超亲，但穗长小于亲本矮格拉的个体就2个，其余均超亲本矮格拉，呈连续分布。一次枝梗数及二次枝梗数的变幅可达2~20和4~51，表型均偏向大穗亲本宝大粒，少数个体出现双向超亲。穗粒数变幅18~271粒/穗，大多数个体穗粒数介于双亲之间，少数个体出现双向超亲现象。F2结实率呈现连续分布，由于是籼粳交群体，F2出现大量结实率较低的个体（图6）。图6 F2群体穗部性状的次数分布Figure.6 Frequency distribution of panicle traits in F2 population注:A.F2群体穗长的次数分布图；B.F2群体一次枝梗的频数次数分布图；C.F2群体二次枝梗的次数分布图；D.F2群体穗粒数的次数分布图；E，F2群体结实率的频数分布直方图；Note: A.Frequency distributions of panicle length in F2 population; B.Frequency distributions of number of second branch in F2 population; C.Frequency distributions of number of second branch in F2 population;; D.Frequency distributions of spikelet grain number in F2 population. E, Frequency distributions of seed setting rate in F2 population2.4 宝大粒/矮格拉F2分离群体粒型的遗传分析 对该群体亲本、F2分离群体的180个株系的谷粒长度、宽度和千粒重的数据进行统计（图7），亲本长宽及千粒重之间具有显著差异，F2群体多数株系表型介于双亲之间，呈连续分布，未出现典型孟德尔遗传分离现象，属于多基因共同控制的数量性状。粒长变幅6.66~12.72mm，没有出现明显的超亲现象；粒宽变幅2.97-4.45mm，出现明显的双向超亲现象，其中30%个体粒宽小于亲本矮格拉；千粒重变幅29.98~64.80g，有明显的双向超亲现象，64%出现千粒重低于亲本矮格拉，5%千粒重高于亲本宝大粒，介于双亲之间的个体只占群体的21%（图8）。 图7 宝大粒、矮格拉及其F2个体的籽粒表型Figure 7 Grain of BDL/AGL and their F2 individuals图8 F2群体籽粒性状的次数分布Figure 8 Frequency distribution of Grain traits in F2 population注A.F2群体粒长次数分布图；B.F2群体粒宽次数分布图；C.F2群体千粒重次数分布图；D..F2群体稃毛密度次数分布图Note:A.Frequency distributions of grain length in F2 population; B.Frequency distributions of grain width in F2 population; C. Frequency distributions of thousand grain weight in F2 population;D, Frequency distributions of density of grain tomentum in F2 population2.5 水稻性状QTL定位2.5.1 株高QTL定位分离群体中共发现2个主效株高QTL位点，分别位于第1和第7染色体。第1染色体上的主效QTL位点qPH1.1位于Y9~RM3602之间，LOD值为12.1，表型贡献率为16.76%，加性效应-12.53，说明该增效位点来自矮杆亲本矮格拉；第7染色体上的株高主效QTL位点qGH7.1位于RM524~A83之间，LOD值为23.3，表型贡献率33.84%，加性效应18.48，说明该增效位点来自亲本宝大粒（图9，表1）。图9 F2群体中定位的株高QTLFigur 9 Mapping of QTL for plant height in F2 populations表1 F2群体中定位到的株高QTL数据统计表Table 1 Date collection of the QTL for plant length in F2 popualtion基因名称Gene Name染色体Chromosome左标记Left Marker右标记Right MarkerLOD值LOD贡献率PVE(%)加性效应Add显性效应DomqPH1.11Y9RM360212.101516.7561-12.52632.5647qGH7.17RM542A8323.345433.842918.48264.77142.5.2 叶型QTL定位群体中检测到4个剑叶长度QTL，分别在第2、第7和第10染色体上，LOD范围在3.86~10.02。剑叶长度QTL qFLL2.1，位于第2染色体的SSR标记RM6639~RM6374之间，LOD值仅为3.86，对表型的贡献率是6.48%，加性效应值为3.61，增效位点来自亲本宝大粒。qFLL7.1位于第7染色体标记A80~A88之间，LOD值为10.02，表型贡献率为18.22%，加性效应值为6.33，为效应值最大的剑叶长度QTL,其增效位点来自亲本宝大粒。qFLL7.2位于第7染色体标记A28~RM3826之间，LOD值4.05，表型贡献率7.03，加性效应值为-0.33，增效位点来自矮格拉，其效应很小。qFLL10.1定位于第10染色体上标记A61~RM7217之间，对表型贡献率为8.65%，加性效应为-4.26，增效来自于亲本矮格拉（图10,表2）。群体中仅检测到1个剑叶宽度QTL qFLW7.1，位于第7染色体上标记RM542~A83之间，LOD值为6.63，对表型贡献率为14.82，加性效应为0.16，该增效位点来自亲本宝大粒。 图10 F2群体中定位的剑叶长及剑叶宽QTLFigure 10 Mapping of QTL for Flag leaf length and width in F2 populations表2 F2群体中定位到的剑叶长和剑叶宽QTLs数据统计表Table 2 Date collection of the QTLs for Flag leaf length and width in F2 popualtion基因名称Gene Name染色体Chromosome左标记Left Marker右标记Right MarkerLOD值LOD贡献率PVE(%)加性效应Add显性效应DomqFLL2.12RM6639RM63743.86 6.48 3.61 -1.71 qFLL7.17A80A88 10.02 18.22 6.33 0.92 qFLL7.27A28RM38264.05 7.03 -0.33 5.37 qFLL10.110A61RM72173.92 8.65 -4.26 0.50 qFLW7.17RM542A836.63 14.82 0.16 0.03 2.5.3 穗型QTL定位 对穗长、一次支梗数、二次支梗数、穗粒数和结实率5个穗部性状进行QTL定位。检测到2个穗长QTL，即qPL2.1位于第2染色体的A105~RM14001之间，LOD值为7.19，表型贡献率为12.35%，加性效应值为2.33；qPL7.1第7染色体的标记A88~A93之间，LOD值为20.05，表型贡献率为29.20%，加性效应值为3.93，增效均来自于亲本宝大粒。检测到1个穗粒数QTL，即 qNP7.1位于第7染色体A93~A82区间，LOD值为10.98，表型贡献率24.57%，加性效应值为33.86，增效来自亲本宝大粒。检测到一次支梗数和二次枝梗数QTL各1个，即qNPB7.1和qNSB7.1，它们分别位于第7染色体标记A93~A82和A88~A93之间，LOD值为7.18和24.15，表型贡献率为17.17%和24.15%。检测到1个结实率QTL qSSR6.1，位于第6染色体W45~Y48之间，LOD值为6.79，表型贡献率为20.97%，加性效应值为-0.0266，增效来自亲本矮格拉（图11,表3）。图11 穗部性状QTL定位结果Figur 11 Mapping of QTL for panicle traits in F2 population表3 F2群体中定位到穗部性状QTLs数据统计表Table 3 Date collection of the QTLs for panicle traits in F2 popualtion基因名称Gene Name染色体Chromosome左标记Left Marker右标记Right MarkerLOD值LOD贡献率PVE(%)加性效应Add显性效应DomqPL2.12A105RM140017.1912.352.39-0.80qPL7.17A88A9320.0529.203.931.10qSNP7.17A93A8210.9824.5733.8612.70qNPB7.17A93A827.1817.171.760.63qNSB7.17A88A9311.0324.156.672.55qSSR6.16W45Y486.7920.97-0.03-0.162.5.4粒型QTL定位在第2、第3和第10染色体定位到4个粒长QTL位点。粒长qGL2.2，位于第2染色体SSR标记RM13606~A105之间，LOD值为10.36，对表型的贡献为22.86%，加性效应值为0.79，增效位点来自亲本宝大粒。粒长qGL2.3，位于在第2染色体SSR标记A105~RM14001之间，LOD值为12.08，对表型贡献率为26.22%，加性效应值为0.86，增效来自亲本宝大粒。粒长 qGL3.3位点，位于第3染色体SSR标记W30~W31之间，LOD值为5.10，对表型贡献率为7.67%，加性效应值为0.49，增效来自于亲本宝大粒。粒长qGL10.1，位于第10染色体标记Y77~W7之间，LOD值为3.85，表型贡献率为5.25%，加性效应为0.41，增效位点来自于亲本宝大粒。在第2和第7染色体上定位到2个粒宽QTL位点。粒宽qGW2.2，位于第2染色体SSR标记RM13606~A105之间，LOD值为8.04，表型贡献率为26.92%，加性效应为0.20，增效来自亲本宝大粒。粒宽qGW7.3，位于第7染色体SSR标记A85~A28之间，LOD值为4.92，表型贡献率为10.32%，加性效应值为0.18，增效来自于亲本宝大粒。在第2染色体定位到2个千粒重QTL位点。qTGW2.1和qTGW2.2，位于第2染色体SSR标记RM5427~RM13606和RM14001~A14之间，LOD值为5.96和8.60，表型贡献率为14.44%和19.72%，加性效应为4.34和4.99，增效均来自于亲本宝大粒。稃毛密度只有定位到一个位点，qDGT2.1位于SSR标记RM13606~A105之间，LOD值为4.66表型贡献率为11.47%，加性效应为0.49，增效来自于亲本宝大粒（图12，表4）。图12 F2群体粒长、粒宽、千粒重及籽粒绒毛度遗传图Figure. 12 The location of grain length, grain width, thousand grain weight and tomentum rate of grain in F2 populations表4 F2群体中定位到粒型性状QTLs数据统计表Table 4 Statistical table of QTLs data in F2 population for orientation to grain type traits基因名称Gene Name染色体Chromosome左标记Left Marker右标记Right MarkerLOD值LOD贡献率PVE(%)加性效应Add显性效应DomqGL2.22RM13606A10510.36 22.86 0.79 0.00 qGL2.32A105RM1400112.08 26.22 0.86 -0.02 qGL3.33W30W315.10 7.67 0.49 0.09 qGL10.110Y77W73.85 5.25 0.41 -0.05 qGW2.22RM13606A1058.04 26.92 0.20 -0.02 qGW7.37A85A284.92 10.32 0.13 -0.02 qTGW2.12RM5427RM136065.96 14.44 4.34 1.74 qTGW2.22RM14001A148.60 19.72 4.98 2.40 qDGT2.12RM13606A1054.66 11.47 0.49 0.44 3讨论3.1 结论与讨论 水稻的主要农艺性状与水稻高产有着直接关系，深入了解水稻主要农艺性状的基因位点对水稻育种起到重要作用。目前世界上对主要农艺性状的QTL定位有很多，且12条染色体上均有分布。 在第2染色体标记RM13606~A105之间检测到qGL2.2和qGW2.1，这 2个QTL位点遗传距离为1cm，相关性较高，推测在这个位点存在一个多效基因，同时控制粒长和粒宽。在第2染色体标记A105~RM14001之间检测出qPL2.1和qGL2.3，这2个QTL位点相距3cm，其相关性较高，2位点之间可能存在连锁。在第2染色体上标记RM5427~RM13606之间检测出来qTGW2.1和qDGT2.1，这2个QTL位点距离相近，可能存在连锁关系。 在第7染色体A80~RM3826之间的12cm内检测到9个QTL位点，qFLL7.1位于33cm位置，qPL7.1和qNSB7.1位于34cm位置，qNPB7.1位于36cM，qSNP7.1位于37cm，qPH7.1位于38cm，qFLW7.1位于40cm，qGW7.3位于43cm，qFLL7.2位于46cm。qGW7.3与qFLW7.1不存在相关性，说明2位点独立遗传，与qPH7.1相关性性较低。qPL7.1与其他8个位点都存在极显著正相关，其中与qFLW7.1位点相关性最小，与qSNP7.1相关性最高。qSNP7.1和qNSB7.1相关性较高，说明这2个QTL存在紧密连锁或是一因多效，与其他位点相关性系数也在45%以上。其他各位点之间也存在这极显著的相关性，具体是否有连锁关系还要进一步验证。 在第2和第7染色体上出现基因聚集的现象，在第2染色体上检测到粒长、粒宽、千粒重、稃毛密度和穗长这些QTL位点，在第7染色体检测到，剑叶长宽、一次和二次枝梗数、穗粒数、穗长、株高和粒宽QTL位点。F2群体在第1和第7染色体上定位到了株高的主效QTL位点。在第1染色体上qPH1.1所在区域已有sd-1和THIS1存在，本研究发现该位点的增效作用来自矮格拉，推断宝大粒中携带隐性半矮杆基因sd-1，而矮格拉中则携带高杆SD-1等位基因。引起矮格拉矮秆的唯一主效位点是位于第7染色体上的另一个控制株高的位点qPH7.1，其增效位点来自宝大粒，矮秆效应来自矮格拉，且该位点尚未被报道。F2群体中qGW2.3、qGL2.2在同一位点，位于着丝粒下方，与2015年报道的控制粒长、粒宽和长宽比的多效基因GS2处于同一位置，且GS2也是用宝大粒来构建的BDLNIL群体进行定位，并且增效位点来自宝大粒。qPL2.1、qPL7.1、qSSR6.1、qNPB7.1、qNPB7.2、qNSB7.1、qFLL7.2、qFLL7.3、qFLW7.1和qDGT2.1这些位点尚未被报道，有待进一步研究。3.2 前景与展望依靠日趋饱和的分子遗传图谱和日益完善的QTL定位方法,近年来对作物QTL 的研究发展很快,目前在许多作物中都已经进行了产量性状的QTL定位。虽然同时也存在许多问题，如当前分子标记辅助的QTL定位只能是初级定位，大多数分子标记定位的 QTL的位置、效应随实验材料、时间和地点而异，而且成本较高等。但是，随着分子生物学技术的发展、数量遗传学研究的不断深入、更高密度遗传图谱的构建、QTL的位置、效应和机理的逐步探明，以及成本较低的基于PCR 的分子标记技术的发展和应用，水稻主要农艺性状QTL定位将在作物的高产和超高产育种中发挥巨大的作用。未来的研究可以多挖掘新的基因位点，对基因位点进行精确定位，通过对基因克隆与转接实现水稻高产育种的目标。致谢本课题与硕士研究生张栩共同实施完成的，在此特表感谢，同时得到武浩、杨彬师兄和尚菲、连光倩、翟雪师姐的鼎力支持，他们中很多人直接协助和参与了田间试验工作，付出了许多辛勤的劳动，在此一并表示衷心的感谢！感谢大学为我们提供的良好学习环境，感谢作物遗传与育种国家重点实验室为我提供课题和完善的实验室条件。衷心地感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授！最后，谨向我的家人和好朋友致以最深切的谢意，感谢你们这四年来对我的理解、关怀和鼓励。参考文献[1] Delseny M,Salses J,Cooke R Rice genomices.Present and future ,2001(1).[2] 左科生,李育,钟平安.水稻理想株型与超高产育种的研究进展[J] .江西农业学报, 2003(1).[3] 孙旭初. 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LAX PANICLE2 of rice encodes a novel nuclear protein and regulates the formation of axillary meristems[J]. Plant Cell ,2011,23(9): 3276-3287.[12] 宫李辉, 高振宇, 马伯军, 钱前.水稻粒形遗传的研究进展[J].植物报,2011,46:(6),597–605.[13] 高志强, 占小登, 梁永书, 程式华, 曹立勇.水稻粒形性状的遗传及相关基因定位与克隆研究进展[J].HEREDITAS (Beijing) ,2011,33(4): 314―321 .[14] Fan CC, Xing YZ, Mao HL, Lu TT, Han B, Xu CG, Li XH,Zhang QF . GS3, a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice, encodes a putative transmembrane protein[J]. Theor Appl Genet,2006, 112:1164–1171.[15]Mao HL, Sun SY, Yao JL, Wang CR, Yu SB, Xu CG, Li XH,Zhang QF . Linking differential domain functions of the GS3 protein to natural variation of grain size in rice[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2010,107:19579–19584.[16]Song XJ, Huang W, Shi M, Zhu MZ, Lin HX . A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase[J]. 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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料和群体构建 3
1.2 方法 3
1.2.1 性状考察3
1.2.2 水稻DNA叶片提取3
1.2.3 PCR反应体系4
1.2.4 PCR扩增测序4
1.2.5 电泳测序 4
1.2.6 分子标记与选择鉴定5
1.2.7 连锁图谱的构建及QTL定位相关软件5
2 实验内容与结果分析5
2.1 宝大粒/矮格拉F2分离群体株高遗传分析6
2.2 宝大粒/矮格拉F2分离群体叶型遗传分析6
2.3 宝大粒/矮格拉F2分离群体穗型遗传分析7
4 宝大粒/矮格拉F2分离群体粒型遗传分析8
2.5 水稻性状QTL定位9
2.5.1 株高QTL定位9
2.5.2 叶型QTL定位10
2.5.3 穗型QTL定位11
2.5.4 粒型QTL定位12
3 讨论12
3.1 讨论与结论12
3.2 前景与展望13
致谢13
参考文献14
水稻F2群体粒型及株型相关性状的QTL定位
引言
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