水稻籼粳交杂种不育基因s29的精细定位
栽培稻籼粳交杂种具有较强的生物学优势，利用这些优势可以使水稻的产量得到极大地提高，但是亚种间杂种通常表现为半不育,这严重地阻碍了强大的杂种优势在生产上的直接利用。本研究通过利用以粳稻Asominori为遗传背景、籼稻IR24为染色体片段供体的一套覆盖全基因组的染色体片段置换系群体为材料，发现置换系CSSL13与背景亲本杂交杂种F1表现为半不育。系统调查了F1的花粉育性、胚囊育性、受精率及其结实率，结果表明杂种F1的花粉萌发正常，激光共聚焦显微观察结果证实了胚囊部分败育是F1半不育的主要原因。随后，利用构建的CSSL13/Asominori的次级分离群体，采用极端个体定位的方法，在位于第二号染色体RM6424和RM250之间定位到一个控制小穗育性基因位点。通过与前人的研究结果比较发现，与 以前报道的S29基因位置相一致，推测为同一个育性基因。通过扩大群体单株数目，最终将S29限定在标记ZH16和ZH3之间484kb的物理距离内。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1表型观察2
1.2.2小穗育性调查2
1.2.3花粉育性调查2
1.2.4花粉离体培养测定花粉离体萌发率 3
1.2.5胚囊育性调查 3
1.2.6饱和授粉实验 3
1.2.7 DNA的提取 3
1.2.8 PCR反应 4
1.2.9引物设计 5
1.2.10聚丙烯酰胺凝电泳5
1.2.11分子连锁图谱的构建及QTL分析5
2结果与分析5
2.1亲本、F1表型分析5
2.2 Asominori和F1花粉育性和花粉离体萌发率分析6
2.3激光共聚焦观察Asominori和F1成熟胚囊及饱和授粉实验的结果分析 7
2.4小穗育性分析8
2.5 S29的初定位9
3讨论 11
致谢12
参考文献12
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
水稻籼粳交杂种不育基因S29的精细定位
引言
水稻属于禾本科禾亚科中的稻属，亚洲栽培稻（Oryza Sativa L.）和非洲栽培稻（Oryza glaberrima Steud.）是稻属中的两个栽培种[1]。籼稻(indica)和粳稻（japonica)[2]就是由亚洲栽培稻不断的变异和遗传分化而形成的两个亚种。两者生理、形态以及分子水平上都表现出非常显著的差异，遗传分化十分明显，从而导致籼粳杂种F1在产量性状及营养器官等方面具有强大的杂种优势[3,4]。但与此同时，籼粳亚种间的生殖隔离使得籼粳杂种产生F1亲和力降低，结实率较低、稳定性较差、米质参差不齐、株高偏高及生育期较长等缺点[5,6]。袁隆平在1996年 [7]首次提出了利用籼粳亚种间杂种优势的设想，认为直接利用亚种间的杂种优势是突破水稻产量最有效且最有希望的途径[8,9,10]。将籼粳杂种的强大生物学优势直接应用并转变为产量优势的重点就是消除杂种不育性。广亲和基因S5n在上世纪80年代被发现，这为籼粳杂种优势的利用提供了很好的契机，一度被广泛应用于解决籼粳交杂种不育这个严峻的问题。但随着研究者们渐渐扩大育种亲本的范围，他们发现即使杂交组合的亲本之一为携带S5n的广亲和品种，其杂种F1仍然会表现出半不育性，广亲和基因S5n还不足以解决籼粳交杂种半不育的问题，该问题比我们想象的更加复杂，要想彻底解决杂种不育这个严峻的问题，我们还必须深入探究杂种不育的原因，并透彻了解其遗传机理。如今杂种不育的问题已经得到了广大的专家学者们的关注和重视。水稻籼粳杂种不育可分为两种（Oka，1988）[11]，一是单倍体不育又称为配子体不育，它是由杂种F1的配子基因型不平衡引起的败育，出现在水稻籼粳杂种F1；二是双倍体不育，又称孢子体不育，它是由产生这些配子的植株基因型所决定的，出现在水稻籼粳杂种F2及其高世代。自从发现亚洲栽培水稻籼粳杂种不育的障碍以来，众多专家学者对籼粳杂种不育的遗传机理进行了大量研究，并提出了一些遗传假设，大致可以概括为：a 细胞质效应，即亚种质核不协调造成杂种F1败育；b 染色体结构差异；c 杂种不育基因控制。目前大多数学者认为是核基因控制籼粳杂种的不育性，并提出了多种水稻亚种间杂种不育的基因模式（丁效华，2000）[12]。得到较多的认同的是Oka提出的重复隐性基因配子致死模型和Kitamura [13]提出的单位点孢子体配子体互作模型。Ikehashi和Araki [14]率先证实了杂种不育性是由位于水稻6号染色体S5位点等位基因的互作造成，随后一系列与S5非等位的杂种不育位点都相继被鉴定出来[1524]。这些育性基因位点的发现和定位，为深入探究籼粳杂种不育性遗传机制提供了坚实的理论基础。本研究拟利用SSR和Indel等分子标记对杂种不育基因S29进行精细定位，获得了可利用的紧密连锁分子标记，为图位克隆和深入了解杂种不育机理打下坚实的基础。
1 材料与方法
1．1 材料
一个粳型品种Asominori做背景亲本和一个籼型品种IR24做插入亲本配置的置换系CSSL13，将粳型品种Asominori与置换系CSSL13杂交得到F1，再将F1自交得到的F2代分离群体用于后续遗传分析和定位研究。所有实验材料均正季种植于大学土桥实验基地，采用与常规大田相同的种植和管理方法。
1．2 方法
1．2．1 表型观察 南京正季于土桥实验基地将亲本Asominori、CSSL13和F1同时种植于田间。各随机选取3株，分别观察株高、颖壳大小、花药、柱头是否有差异。
1．2．2 小穗育性调查 在水稻成熟期,随机选取10株水稻植株，在每株选取3个结实率相当的小穗,记录每个小穗上半部的结实率。统计时,以3个小穗的结实率的平均值作为该水稻植株的小穗育性，该群体的小穗育性则为选取的10株水稻植株的平均小穗育性。
1．2．3 花粉育性调查 花粉育性调查采用1%I2KI染色法。在供试材料开花前1一2天从每个单株小穗的上中部取3朵颖花，置于乙醇：冰乙酸（3：1）溶液中固定，置于4℃冰箱保存。对各个单株的花粉进行镜检时，取6个花药中的1个花药，观察花粉育性，用1% I2 KI染色、压片，然后用10×15倍显微镜观察。供试的Asominori和F1材料各制片3张，每张片子观察3个视野，保证每个视野的花粉粒总数在200粒以上。根据花粉染色情况及其形态特征判断其育性，形状不规则、呈黄色或淀粉填充不完整的花粉粒均为不育花粉粒，只有圆形、黑褐色且淀粉填充完整的花粉粒才是可育花粉粒。花粉育性即为可育花粉粒占总花粉粒的比值的平均值。
1．2．4 花粉离体培养测定花粉萌发率 固体培养基（10mL）配方如下表：
表1 固体培养基配方
Table1 The formula of solid medium
Component
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1表型观察2
1.2.2小穗育性调查2
1.2.3花粉育性调查2
1.2.4花粉离体培养测定花粉离体萌发率 3
1.2.5胚囊育性调查 3
1.2.6饱和授粉实验 3
1.2.7 DNA的提取 3
1.2.8 PCR反应 4
1.2.9引物设计 5
1.2.10聚丙烯酰胺凝电泳5
1.2.11分子连锁图谱的构建及QTL分析5
2结果与分析5
2.1亲本、F1表型分析5
2.2 Asominori和F1花粉育性和花粉离体萌发率分析6
2.3激光共聚焦观察Asominori和F1成熟胚囊及饱和授粉实验的结果分析 7
2.4小穗育性分析8
2.5 S29的初定位9
3讨论 11
致谢12
参考文献12
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
水稻籼粳交杂种不育基因S29的精细定位
引言
水稻属于禾本科禾亚科中的稻属，亚洲栽培稻（Oryza Sativa L.）和非洲栽培稻（Oryza glaberrima Steud.）是稻属中的两个栽培种[1]。籼稻(indica)和粳稻（japonica)[2]就是由亚洲栽培稻不断的变异和遗传分化而形成的两个亚种。两者生理、形态以及分子水平上都表现出非常显著的差异，遗传分化十分明显，从而导致籼粳杂种F1在产量性状及营养器官等方面具有强大的杂种优势[3,4]。但与此同时，籼粳亚种间的生殖隔离使得籼粳杂种产生F1亲和力降低，结实率较低、稳定性较差、米质参差不齐、株高偏高及生育期较长等缺点[5,6]。袁隆平在1996年 [7]首次提出了利用籼粳亚种间杂种优势的设想，认为直接利用亚种间的杂种优势是突破水稻产量最有效且最有希望的途径[8,9,10]。将籼粳杂种的强大生物学优势直接应用并转变为产量优势的重点就是消除杂种不育性。广亲和基因S5n在上世纪80年代被发现，这为籼粳杂种优势的利用提供了很好的契机，一度被广泛应用于解决籼粳交杂种不育这个严峻的问题。但随着研究者们渐渐扩大育种亲本的范围，他们发现即使杂交组合的亲本之一为携带S5n的广亲和品种，其杂种F1仍然会表现出半不育性，广亲和基因S5n还不足以解决籼粳交杂种半不育的问题，该问题比我们想象的更加复杂，要想彻底解决杂种不育这个严峻的问题，我们还必须深入探究杂种不育的原因，并透彻了解其遗传机理。如今杂种不育的问题已经得到了广大的专家学者们的关注和重视。水稻籼粳杂种不育可分为两种（Oka，1988）[11]，一是单倍体不育又称为配子体不育，它是由杂种F1的配子基因型不平衡引起的败育，出现在水稻籼粳杂种F1；二是双倍体不育，又称孢子体不育，它是由产生这些配子的植株基因型所决定的，出现在水稻籼粳杂种F2及其高世代。自从发现亚洲栽培水稻籼粳杂种不育的障碍以来，众多专家学者对籼粳杂种不育的遗传机理进行了大量研究，并提出了一些遗传假设，大致可以概括为：a 细胞质效应，即亚种质核不协调造成杂种F1败育；b 染色体结构差异；c 杂种不育基因控制。目前大多数学者认为是核基因控制籼粳杂种的不育性，并提出了多种水稻亚种间杂种不育的基因模式（丁效华，2000）[12]。得到较多的认同的是Oka提出的重复隐性基因配子致死模型和Kitamura [13]提出的单位点孢子体配子体互作模型。Ikehashi和Araki [14]率先证实了杂种不育性是由位于水稻6号染色体S5位点等位基因的互作造成，随后一系列与S5非等位的杂种不育位点都相继被鉴定出来[1524]。这些育性基因位点的发现和定位，为深入探究籼粳杂种不育性遗传机制提供了坚实的理论基础。本研究拟利用SSR和Indel等分子标记对杂种不育基因S29进行精细定位，获得了可利用的紧密连锁分子标记，为图位克隆和深入了解杂种不育机理打下坚实的基础。
1 材料与方法
1．1 材料
一个粳型品种Asominori做背景亲本和一个籼型品种IR24做插入亲本配置的置换系CSSL13，将粳型品种Asominori与置换系CSSL13杂交得到F1，再将F1自交得到的F2代分离群体用于后续遗传分析和定位研究。所有实验材料均正季种植于大学土桥实验基地，采用与常规大田相同的种植和管理方法。
1．2 方法
1．2．1 表型观察 南京正季于土桥实验基地将亲本Asominori、CSSL13和F1同时种植于田间。各随机选取3株，分别观察株高、颖壳大小、花药、柱头是否有差异。
1．2．2 小穗育性调查 在水稻成熟期,随机选取10株水稻植株，在每株选取3个结实率相当的小穗,记录每个小穗上半部的结实率。统计时,以3个小穗的结实率的平均值作为该水稻植株的小穗育性，该群体的小穗育性则为选取的10株水稻植株的平均小穗育性。
1．2．3 花粉育性调查 花粉育性调查采用1%I2KI染色法。在供试材料开花前1一2天从每个单株小穗的上中部取3朵颖花，置于乙醇：冰乙酸（3：1）溶液中固定，置于4℃冰箱保存。对各个单株的花粉进行镜检时，取6个花药中的1个花药，观察花粉育性，用1% I2 KI染色、压片，然后用10×15倍显微镜观察。供试的Asominori和F1材料各制片3张，每张片子观察3个视野，保证每个视野的花粉粒总数在200粒以上。根据花粉染色情况及其形态特征判断其育性，形状不规则、呈黄色或淀粉填充不完整的花粉粒均为不育花粉粒，只有圆形、黑褐色且淀粉填充完整的花粉粒才是可育花粉粒。花粉育性即为可育花粉粒占总花粉粒的比值的平均值。
1．2．4 花粉离体培养测定花粉萌发率 固体培养基（10mL）配方如下表：
表1 固体培养基配方
Table1 The formula of solid medium
Component
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