灰霉病菌甲硫氨酸生物合成途径中8个基因的克隆及其与嘧霉胺抗药性关系分析
甲硫氨酸生物合成途径是灰霉病菌重要的生理生化过程，共有17个相关基因参与调控甲硫氨酸的生物合成。已有的研究表明嘧霉胺的作用原理与灰霉病菌中的甲硫氨酸的生物合成途径相关。该药剂创制于上世纪八十年代，对该病的控制作出了巨大贡献，但几年之后，田间出现了抗药性，近几年抗药性问题严重，但其抗性机理和作用机理还不是十分明确。所以该课题利用筛选计量法筛选出灰霉病菌对嘧霉胺敏感和高抗菌株，然后在核基因组数据库中查找病原菌中甲硫氨酸合成途径主要的8个相关基因并对其逐一进行克隆，比对敏感和抗性菌株之间的碱基序列，找出了突变位点，该突变发生于BC1G_00010基因的第117位密码子和基因BC1G_03241的第425位密码子上，进而初步明确了上述8个基因是否与其嘧霉胺抗性相关，为进一步研究其抗性机制奠定理论基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract..1
Key words.1
引言.2
1 材料与方法2
1.1 材料..2
1.1.1供试的菌株..2
1.1.2供试培养基..2
1.2 方法..2
1.2.1 菌株转接..2
1.2.2菌丝活化.2
1.2.3菌体液体摇培.2
1.2.4基因组DNA提取2
1.2.5 目的基因的克隆和分析3
1.2.6琼脂糖凝胶电泳检测技术.....3
2 结果与分析.3
2.1退火温度筛选......3
2.2目的基因克隆检测..4
2.3基因序列比对与分析5
2.3.1敏感菌株与参考菌株B510 的基因比对分析5
2.3.2嘧霉胺抗、感菌株间的基因比对分析6
3 讨论6
致谢7
参考文献.7
灰霉病菌甲硫氨酸生物合成途径中8个基因的克隆
及其与嘧霉胺抗药性关系分析
引言
引言 由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的草莓灰霉病是世界各国草莓生产上的主要病害[1]，在中国各草莓产区无论保护地栽培还是露地栽培均有发生 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
，尤其是保护地草莓生产发生普遍、危害最为严重。据调查：病害造成的烂果减产10%—30%以上，重者可达50%以上，严重影响草莓的产量和品质。灰霉病菌具有繁殖快,遗传变异大和适合度高的特点,连续使用同一药剂易产生抗药性[2]。1971年世界上首次报道了在荷兰温窒中仙客来上发现了灰霉病菌抗多菌灵菌株(Bellen和Seholten,1971);1987年周明国等在南京、上海等地也发现了灰霉病菌抗多菌灵菌株[3、4]。目前,灰葡萄孢已对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、N苯氨基甲酸酯类和苯胺基嘧啶类杀菌剂产生了不同程度的抗性[5]。
嘧霉胺低毒，水溶解性为0.121g/L。兼具保护和治疗作用,叶间疏导性不强。在根部施用嘧霉胺时表现出较强的内吸性能[6]。对二甲酞亚胺类、苯并咪唑类以及乙霉威已经产生抗性的菌株,也有很好的防治效果。但近些年随着嘧霉胺的广泛使用，在田间已经产生大量的草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗性菌株[7]。
所以本文以灰霉病菌对嘧霉胺敏感和抗性菌株出发，克隆出参与调控甲硫氨酸生物合成途径的17个相关基因[8、9]，并对其进行测序比对，找到DNA上的突变位点。目的是从分子水平找到抗性机制，为研究嘧霉胺对草莓灰霉病菌的毒理提供理论依据[10]，同时也对于开发新型杀菌剂具有一定的指导作用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
嘧霉胺敏感菌株B812
嘧霉胺高抗菌株B81
1.1.2供试培养基
1)PDA培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼脂15~20g 最后定容至1000mL。
2)PDB液体培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 最后定容至1000mL。
1.2方法
1.2.1菌株活化
从低温保存菌种的试管中挑取菌丝块转接到PDA平板上，25℃恒温箱中培养三天。
1.2.2菌丝转接
挑取已活化菌株的菌丝块继续转接到新的PDA平板上，25℃恒温箱中继续培养三天。
1.2.3菌体液体摇培
沿着菌落边缘打取5mm菌碟接种到PDB培养液中，每100mL接种10个菌碟。175rpm, 25℃摇培3天后，收集菌丝。
1.2.4基因组DNA提取
1）取菌丝0.2g, 加入少许石英砂在液氮中研磨成粉末；
2）取适量的菌丝粉末于2mL离心管中，加入700μL预热的CTAB提取液充分混匀，65℃水浴2h；
3) 12000rpm离心10min,取上清，用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提;
4) 12000rpm离心10min,取上清，用等体积氯仿抽提;
5) 12000rpm离心10min,取上清，加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，轻轻颠倒混匀，20℃沉淀2h以上。
6）12000rpm离心10min,弃上清，用70%乙醇洗涤2次，自然晾干后溶于80μLddH2O中, 20℃保存备用。
1.2.5目的基因的克隆和分析
本实验根据近源种B05.10核基因组[11]，对参与甲硫氨酸（methionine）生物合成途径部分基因 （BC1G_00010 ，BC1G_00083， BC1G_00725， BC1G_00847 ，BC1G_03241， BC1G_04337 ，BC1G_04602 ，BC1G_06060），设计了基因特异性引物（引物序列如表1），分别扩增了敏感和高抗菌株甲硫氨酸（methionine）途径中的相关基因。
PCR反应体系25μL，其中0.25μL LA Tap 酶、10×buffer 2.5μL、Mg2+ 2.5μL、dNTP 4μL 10μmol/L的正向引物和反向引物各1μL、DNA模板25ng, ddH2O 补足到25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min; 94℃变性30s,X℃退火30s,72℃延Y min(各基因PCR退火温度和延伸时间如表1)，35个循环；;4℃保存[12]。
1.2.6琼脂糖凝胶电泳检测克隆产物
目录
摘要1
关键词1
Abstract..1
Key words.1
引言.2
1 材料与方法2
1.1 材料..2
1.1.1供试的菌株..2
1.1.2供试培养基..2
1.2 方法..2
1.2.1 菌株转接..2
1.2.2菌丝活化.2
1.2.3菌体液体摇培.2
1.2.4基因组DNA提取2
1.2.5 目的基因的克隆和分析3
1.2.6琼脂糖凝胶电泳检测技术.....3
2 结果与分析.3
2.1退火温度筛选......3
2.2目的基因克隆检测..4
2.3基因序列比对与分析5
2.3.1敏感菌株与参考菌株B510 的基因比对分析5
2.3.2嘧霉胺抗、感菌株间的基因比对分析6
3 讨论6
致谢7
参考文献.7
灰霉病菌甲硫氨酸生物合成途径中8个基因的克隆
及其与嘧霉胺抗药性关系分析
引言
引言 由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的草莓灰霉病是世界各国草莓生产上的主要病害[1]，在中国各草莓产区无论保护地栽培还是露地栽培均有发生 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
，尤其是保护地草莓生产发生普遍、危害最为严重。据调查：病害造成的烂果减产10%—30%以上，重者可达50%以上，严重影响草莓的产量和品质。灰霉病菌具有繁殖快,遗传变异大和适合度高的特点,连续使用同一药剂易产生抗药性[2]。1971年世界上首次报道了在荷兰温窒中仙客来上发现了灰霉病菌抗多菌灵菌株(Bellen和Seholten,1971);1987年周明国等在南京、上海等地也发现了灰霉病菌抗多菌灵菌株[3、4]。目前,灰葡萄孢已对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、N苯氨基甲酸酯类和苯胺基嘧啶类杀菌剂产生了不同程度的抗性[5]。
嘧霉胺低毒，水溶解性为0.121g/L。兼具保护和治疗作用,叶间疏导性不强。在根部施用嘧霉胺时表现出较强的内吸性能[6]。对二甲酞亚胺类、苯并咪唑类以及乙霉威已经产生抗性的菌株,也有很好的防治效果。但近些年随着嘧霉胺的广泛使用，在田间已经产生大量的草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗性菌株[7]。
所以本文以灰霉病菌对嘧霉胺敏感和抗性菌株出发，克隆出参与调控甲硫氨酸生物合成途径的17个相关基因[8、9]，并对其进行测序比对，找到DNA上的突变位点。目的是从分子水平找到抗性机制，为研究嘧霉胺对草莓灰霉病菌的毒理提供理论依据[10]，同时也对于开发新型杀菌剂具有一定的指导作用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
嘧霉胺敏感菌株B812
嘧霉胺高抗菌株B81
1.1.2供试培养基
1)PDA培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼脂15~20g 最后定容至1000mL。
2)PDB液体培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 最后定容至1000mL。
1.2方法
1.2.1菌株活化
从低温保存菌种的试管中挑取菌丝块转接到PDA平板上，25℃恒温箱中培养三天。
1.2.2菌丝转接
挑取已活化菌株的菌丝块继续转接到新的PDA平板上，25℃恒温箱中继续培养三天。
1.2.3菌体液体摇培
沿着菌落边缘打取5mm菌碟接种到PDB培养液中，每100mL接种10个菌碟。175rpm, 25℃摇培3天后，收集菌丝。
1.2.4基因组DNA提取
1）取菌丝0.2g, 加入少许石英砂在液氮中研磨成粉末；
2）取适量的菌丝粉末于2mL离心管中，加入700μL预热的CTAB提取液充分混匀，65℃水浴2h；
3) 12000rpm离心10min,取上清，用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提;
4) 12000rpm离心10min,取上清，用等体积氯仿抽提;
5) 12000rpm离心10min,取上清，加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，轻轻颠倒混匀，20℃沉淀2h以上。
6）12000rpm离心10min,弃上清，用70%乙醇洗涤2次，自然晾干后溶于80μLddH2O中, 20℃保存备用。
1.2.5目的基因的克隆和分析
本实验根据近源种B05.10核基因组[11]，对参与甲硫氨酸（methionine）生物合成途径部分基因 （BC1G_00010 ，BC1G_00083， BC1G_00725， BC1G_00847 ，BC1G_03241， BC1G_04337 ，BC1G_04602 ，BC1G_06060），设计了基因特异性引物（引物序列如表1），分别扩增了敏感和高抗菌株甲硫氨酸（methionine）途径中的相关基因。
PCR反应体系25μL，其中0.25μL LA Tap 酶、10×buffer 2.5μL、Mg2+ 2.5μL、dNTP 4μL 10μmol/L的正向引物和反向引物各1μL、DNA模板25ng, ddH2O 补足到25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min; 94℃变性30s,X℃退火30s,72℃延Y min(各基因PCR退火温度和延伸时间如表1)，35个循环；;4℃保存[12]。
1.2.6琼脂糖凝胶电泳检测克隆产物
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