大豆疫霉rxlr效应分子avh262促进疫霉菌侵染的研究
摘要：大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一。大豆疫霉基因组中有将近400个RxLR效应分子，研究发现效应分子的RxLR motif可以与植物细胞膜上的PI3P结合，帮助效应分子进入寄主细胞内。不同的大豆疫霉效应分子在植物细胞中的亚细胞定位不同，有研究发现，效应分子功能的差异与其定位存在重要联系。我们挑选了效应分子Avh262进行研究，通过克隆该效应分子，构建不同的缺失突变体，将该效应分子和突变体在烟草中表达，观察这些突变体的亚细胞定位的改变和促侵染作用的变化，从而进一步加深对植物与病原菌的互作机制的理解。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 菌株材料2
1.1.2 植物材料2
1.2 载体构建及大肠杆菌转化2
1.2.1 Avh262及其突变体的获得2
1.2.2 载体构建3
1.2.3 大肠杆菌转化3
1.2.3.1 大肠杆菌JM109感受态制备3
1.2.3.2热击法转化大肠杆菌4
1.3 提取质粒及农杆菌转化4
1.3.1 大肠杆菌质粒提取4
1.3.2 农杆菌转化5
1.3.2.1 农杆菌GV3101感受态制备5
1.3.2.2 电击法转化农杆菌5
1.4 注射烟草5
1.4.1 农杆菌悬浮缓冲液的配制5
1.4.2 农杆菌悬浮缓冲液洗农杆菌5
1.4.3 烟草叶片注射5
1.5 Avh262及其突变体亚细胞定位及Western验证5
1.5.1 Avh262及其突变体的亚细胞定位6
1.5.2 Western验证蛋白表达6
1.5.2.1植物蛋白提取6
1.5.2.2 Western验证6
1.6辣椒疫霉侵染烟草实验 6
1.6.1 辣椒疫霉的培养6
1.6.2
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
辣椒疫霉侵染烟草6
2 结果与分析7
2.1 Avh262的功能域分析及突变体设计7
2.2 Avh262及其突变体M1，M2，M3在植物细胞中的亚细胞定位 8
2.3 辣椒疫霉侵染注射后的烟草所产生病斑大小8
2.3.1 Avh262促进疫霉菌的侵染8
2.3.2 Avh262的第6082位氨基酸对其促进侵染是必需的8
3 讨论 9
致谢10
参考文献10
附录12
大豆疫霉RxLR效应分子Avh262促进疫霉菌侵染的研究
引言
大豆疫霉(Phytophthora sojae）能够侵染大豆，引起大豆根腐病，是世界范围内大豆生产上一种毁灭性的病害[1]。该病自从1984年在美国首次发现以来，迄今在世界大豆主要生产区呈扩大蔓延趋势，其危害巨大，毁灭性极强。相对于真菌和细菌，疫霉菌基因组较大并且遗传转化困难，对疫霉菌致病机理的研究进展非常缓慢。目前生产上一些防治真菌的药物对疫霉的防治效果并不是很突出，所以从分子生物学的手段研究大豆疫霉与植物互作的机制对于寻找新的杀菌剂靶标意义重大，有助于开发新的杀菌剂，为防止该病原菌制定策略提供理论依据[23]。
植物对病原菌的抗性可以分为两个层次，即植物识别病原菌的保守分子模式PAMP(Pathogenassociated molecular pattern)产生的先天免疫PTI(PAMP triggered immunity)和识别效应分子产生的ETI(Effectorstriggered immunity)。其中PTI是一种普遍存在且较弱的抗性，可以针对多数病原菌的侵染。病原菌会通过分泌效应分子阻止植物细胞的PTI，而植物细胞相继又通过NBSLRR类抗病蛋白识别效应分子产生新的免疫反应ETI[4]。PTI和ETI的产生将抑制甚至完全阻断病原菌的继续扩展。
随着研究的不断深入，研究发现同绝大多数动植物病原菌一样，植物病原卵菌在与寄主植物互作的过程中，也会分泌效应分子蛋白(Effectors)进入寄主细胞中，通过破坏或者干扰细胞的不同部位来改变细胞的结构或代谢途径，从而促进自身的侵入和繁殖[46]。在植物与卵菌的长期协同进化过程中，卵菌为了完成对植物的成功侵染必须破坏寄主植物的防卫反应系统，而植物为了生存则必须抵抗卵菌对其防卫系统的破坏，在这种长期的相互斗争中，卵菌的效应分子被输送到寄主细胞的不同部位来破坏或延缓寄主的防卫反应，从而营造一个适于自身侵入和繁殖的环境。效应分子是由卵菌分泌的、可以改变寄主植物细胞的结构和代谢途径，从而促进对寄主植物成功侵染的外泌型蛋白分子[7]。
对病原菌效应分子的鉴定及功能分析是过去20多年植物病理学最重要的进展之一[89]。研究发现，疫霉基因组中存在的一类特殊的效应分子：它们在N端均含有一个信号肽，后面紧随着一个保守的RxLRdEER motif，这类效应分子通常都为100—300个氨基酸[7]。大豆疫霉基因组编码将近400个RxLR效应分子，研究发现效应分子的RxLR motif可以与植物细胞膜上的PI3P结合，帮助效应分子进入寄主细胞内[8]。目前的研究已经发现一些效应分子能够在植物细胞内发挥毒性功能，抑制植物的免疫反应，帮助病原菌的侵染[5,78]。
研究发现，效应分子功能与其定位存在着重要的联系，大豆疫霉的不同效应分子在植物中的亚细胞定位是多样的。大豆疫霉RxLR效应分子定位在其功能发挥的过程中功能中起着重要的作用 [911]。致病疫霉RxLR效应分子的核定位信号对于效应蛋白入寄主细胞核起着重要的引导作用[1114]。本研究通过对一个效应分子Avh262的克隆和构建其突变体，使Avh262及其突变体在烟草叶片中表达，定位Avh262的功能域，观察这些突变体的亚细胞定位与毒性功能之间的关系，从而对病原菌和寄主植物互作的机制进行初探。
1 材料与方法
1.1 基本材料
1.1.1 菌株材料
大豆疫霉菌株P6497(Race 2)为美国俄勒冈州立大学的Brett M. Tyler教授所馈赠，由大学植病系真菌实验室保存。菌株保存在10% V8固体培养基，保存温度是10℃。
大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株JM109、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101为本实验室保存。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 菌株材料2
1.1.2 植物材料2
1.2 载体构建及大肠杆菌转化2
1.2.1 Avh262及其突变体的获得2
1.2.2 载体构建3
1.2.3 大肠杆菌转化3
1.2.3.1 大肠杆菌JM109感受态制备3
1.2.3.2热击法转化大肠杆菌4
1.3 提取质粒及农杆菌转化4
1.3.1 大肠杆菌质粒提取4
1.3.2 农杆菌转化5
1.3.2.1 农杆菌GV3101感受态制备5
1.3.2.2 电击法转化农杆菌5
1.4 注射烟草5
1.4.1 农杆菌悬浮缓冲液的配制5
1.4.2 农杆菌悬浮缓冲液洗农杆菌5
1.4.3 烟草叶片注射5
1.5 Avh262及其突变体亚细胞定位及Western验证5
1.5.1 Avh262及其突变体的亚细胞定位6
1.5.2 Western验证蛋白表达6
1.5.2.1植物蛋白提取6
1.5.2.2 Western验证6
1.6辣椒疫霉侵染烟草实验 6
1.6.1 辣椒疫霉的培养6
1.6.2
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
辣椒疫霉侵染烟草6
2 结果与分析7
2.1 Avh262的功能域分析及突变体设计7
2.2 Avh262及其突变体M1，M2，M3在植物细胞中的亚细胞定位 8
2.3 辣椒疫霉侵染注射后的烟草所产生病斑大小8
2.3.1 Avh262促进疫霉菌的侵染8
2.3.2 Avh262的第6082位氨基酸对其促进侵染是必需的8
3 讨论 9
致谢10
参考文献10
附录12
大豆疫霉RxLR效应分子Avh262促进疫霉菌侵染的研究
引言
大豆疫霉(Phytophthora sojae）能够侵染大豆，引起大豆根腐病，是世界范围内大豆生产上一种毁灭性的病害[1]。该病自从1984年在美国首次发现以来，迄今在世界大豆主要生产区呈扩大蔓延趋势，其危害巨大，毁灭性极强。相对于真菌和细菌，疫霉菌基因组较大并且遗传转化困难，对疫霉菌致病机理的研究进展非常缓慢。目前生产上一些防治真菌的药物对疫霉的防治效果并不是很突出，所以从分子生物学的手段研究大豆疫霉与植物互作的机制对于寻找新的杀菌剂靶标意义重大，有助于开发新的杀菌剂，为防止该病原菌制定策略提供理论依据[23]。
植物对病原菌的抗性可以分为两个层次，即植物识别病原菌的保守分子模式PAMP(Pathogenassociated molecular pattern)产生的先天免疫PTI(PAMP triggered immunity)和识别效应分子产生的ETI(Effectorstriggered immunity)。其中PTI是一种普遍存在且较弱的抗性，可以针对多数病原菌的侵染。病原菌会通过分泌效应分子阻止植物细胞的PTI，而植物细胞相继又通过NBSLRR类抗病蛋白识别效应分子产生新的免疫反应ETI[4]。PTI和ETI的产生将抑制甚至完全阻断病原菌的继续扩展。
随着研究的不断深入，研究发现同绝大多数动植物病原菌一样，植物病原卵菌在与寄主植物互作的过程中，也会分泌效应分子蛋白(Effectors)进入寄主细胞中，通过破坏或者干扰细胞的不同部位来改变细胞的结构或代谢途径，从而促进自身的侵入和繁殖[46]。在植物与卵菌的长期协同进化过程中，卵菌为了完成对植物的成功侵染必须破坏寄主植物的防卫反应系统，而植物为了生存则必须抵抗卵菌对其防卫系统的破坏，在这种长期的相互斗争中，卵菌的效应分子被输送到寄主细胞的不同部位来破坏或延缓寄主的防卫反应，从而营造一个适于自身侵入和繁殖的环境。效应分子是由卵菌分泌的、可以改变寄主植物细胞的结构和代谢途径，从而促进对寄主植物成功侵染的外泌型蛋白分子[7]。
对病原菌效应分子的鉴定及功能分析是过去20多年植物病理学最重要的进展之一[89]。研究发现，疫霉基因组中存在的一类特殊的效应分子：它们在N端均含有一个信号肽，后面紧随着一个保守的RxLRdEER motif，这类效应分子通常都为100—300个氨基酸[7]。大豆疫霉基因组编码将近400个RxLR效应分子，研究发现效应分子的RxLR motif可以与植物细胞膜上的PI3P结合，帮助效应分子进入寄主细胞内[8]。目前的研究已经发现一些效应分子能够在植物细胞内发挥毒性功能，抑制植物的免疫反应，帮助病原菌的侵染[5,78]。
研究发现，效应分子功能与其定位存在着重要的联系，大豆疫霉的不同效应分子在植物中的亚细胞定位是多样的。大豆疫霉RxLR效应分子定位在其功能发挥的过程中功能中起着重要的作用 [911]。致病疫霉RxLR效应分子的核定位信号对于效应蛋白入寄主细胞核起着重要的引导作用[1114]。本研究通过对一个效应分子Avh262的克隆和构建其突变体，使Avh262及其突变体在烟草叶片中表达，定位Avh262的功能域，观察这些突变体的亚细胞定位与毒性功能之间的关系，从而对病原菌和寄主植物互作的机制进行初探。
1 材料与方法
1.1 基本材料
1.1.1 菌株材料
大豆疫霉菌株P6497(Race 2)为美国俄勒冈州立大学的Brett M. Tyler教授所馈赠，由大学植病系真菌实验室保存。菌株保存在10% V8固体培养基，保存温度是10℃。
大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株JM109、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101为本实验室保存。
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