vigs技术对棉花叶片密生茸毛候选基因（ght）的功能分析
茸毛是植物表皮的凸起，由单细胞或多细胞发育而来。研究表明茸毛的发育机制与棉纤维的发育机制存在一定的相似性，因此研究茸毛的发育机制，在一定程度上为揭示棉纤维发育机理提供参考。本研究对多茸毛亲本T586叶片密生茸毛候选基因（GhT）进行基于VIGS技术的沉默处理，研究结果发现，与对照相比，多茸毛亲本T586叶片及茎秆茸毛明显变少；进一步选取了我室保存的三个其他多毛材料，分别将其GhT基因沉默后，发现叶片及茎秆茸毛亦明显变少。表明GhT基因在棉花叶片茸毛发育过程中起着重要作用。研究结果为今后培育多毛棉花材料及探求叶片茸毛与种子纤维发育关系奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.2 方法 3
1.2.1 材料培养3
1.2.2 农杆菌感受态制备3
1.2.3 TRVVIGS载体构建和储藏3
1.2.4 基因沉默处理3
1.2.5 实时荧光定量PCR分析3
2 结果与分析4
2.1 TRVVIGS载体的构建4
2.2注射以及基因沉默后的植物表型变化和分析5
2.3 其他茸毛品种的TRVVIGS结果6
3 讨论 7
致谢7
参考文献7
基于VIGS技术对棉花叶片密生茸毛候选基因（GhT）的功能分析
种子科学与工程学生 米新月
引言
引言：茸毛是植物表皮的凸起，由单细胞或多细胞发育而来。根据植物种类不同，茸毛在植物上的分布也不同，比如叶、茎、叶柄、花瓣、种皮等，大体上分为两类：无腺体茸毛以及有腺体茸毛或称腺毛[1]。许多植物体表都具有茸毛，茸毛在植物的生长和发育中起着重要的作用，可以增强植物抗逆性，包括防紫外线、抗旱性、抗虫性等。
棉花是世界上重要的经济作物，是纺织工业天然纤维的主要来源。棉种叶片及茎秆表面密生茸毛，可以增强其抗虫性及抗旱性。杨国枝[2]等通过形态指标来鉴定花生茎节茸毛与抗旱性的关系从而指出：花生中上部茎节的茸毛密度
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
和抗旱性有关，茎节茸毛密的品种抗旱性强。而棉花茎干和叶片密生茸毛的性状对蚜虫和其他刺吸式口器害虫有较强的抗性，可以有效地减轻害虫危害[3]。美国对棉花多茸毛性状的研究较多，但是埃及是最先利用该性状来培育品种的国家，该国于20世纪40年代就育成多茸毛品种Bathimlol。(前)苏联报道，澳洲棉和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)两种多毛棉花能够抗棉叶螨类和蚜虫。非洲用多毛的棉花品种防治棉叶蝉也取得成功，这和茸毛阻止害虫产卵有关。根据研究，棉花叶片背面中脉上的茸毛长度和叶蝉产卵量呈负相关。中国农科院棉花研究所在20世纪70年代从辽宁辽阳引进多茸毛种质系多毛早3号，经过鉴定，结果表明：该种质系具有明显的抗棉蚜作用。四川省棉花研究所通过将多茸毛的陆海杂种抗蚜材料抗77和拥有亚洲棉(Gossypium arboreum)系统的苏棉1号杂交，经过连续的多代选择后，培育了对棉蚜和棉红蜘蛛有高度抗性的棉花新品种川棉109。中国农科院棉花研究所用中棉所3号培育而来的7259为多茸毛亲本，复合杂交和分系比较，最后育成了具有优良抗蚜性的多茸毛品种中棉所17和中棉所19。顾恒琴[4]等研究表明，多茸毛抗蚜性不仅仅由于叶片茸毛密度大小，更多的是心叶和幼叶叶片背部的茸毛密度及其在叶背上的分布情况。
研究表明，在棉花中，控制茸毛发育的机制跟控制棉花纤维发育的机制存在相似性，研究茸毛的发育机制可以在一定程度上揭示棉花纤维发育的机理。拟南芥上的无腺体茸毛是用来研究细胞分化和模式形成分子机理的极佳实验对象。拟南芥茸毛的产生和分布受到时间和空间的严格控制。在拟南芥营养生长早期，茸毛只分布在莲座叶的近轴面，而在营养生长后期近轴和远轴面都有分布。生殖生长期间，主花序的茎和花上的茸毛数量会逐渐减少。已知超过30个不同的基因控制茸毛的发育过程[5]。大量基因和分子分析表明一个由三大类转录因子组成的网络在茸毛发育过程中发挥着重要的作用，它们分别是：R2R3MYB蛋白，bHLH转录因子，WD40蛋白。这三种转录因子形成一个三聚激活子复合体，MYBbHLHWDR，该复合体正向调控下游目的基因的表达，而这些基因轮流诱导茸毛的形成。单重复R3MYB蛋白是茸毛发育过程中的反向调节因子[5]。
基因功能的激活以及丧失是我们了解基因功能的两条基本途径。基因功能丧失的研究主要是通过敲除基因包括TDNA插入突变，基因重组以及转座子插入或者通过RNA干扰（RNAi）和病毒介导的基因沉默来下调基因的表达水平。病毒诱导的基因沉默（VIGS）是植物对抗病毒入侵时的防御机制之一，可以识别RNA病毒和DNA病毒，然后激发siRNA介导的PTGS降解病毒序列[6]。病毒介导的基因沉默(virusinduced gene silencing, VIGS)是植物体内普遍存在的一种遗传免疫机制，属于转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing, PTGS)。当携带含有内源基因片段的病毒载体侵染寄主植物后，能够激活植物自身的免疫系统；在识别并降解病毒RNA的同时也会产生含内源目的基因的microRNA，这些microRNA与靶基因的mRNA结合，之后被Dicer酶降解，从而使目的基因表达水平下降或功能丧失。根据构建载体的病毒不同分为RNA病毒载体，DNA病毒载体，卫星病毒载体等3类。其中，基于RNA病毒烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）介导的基因沉默（TRVVIGS）应用最为广泛。在棉花中，多个研究机构亦建立起TRVVIGS 技术，并将该技术应用于棉花不同基因的功能研究[710]。
本研究拟对前期克隆到的棉花叶片密生茸毛基因（GhT），构建基因转化的TRVVIGS载体，沉默目的基因研究其功能。希望通过本研究对克隆到的茸毛基因进行进一步的功能研究，为接下来研究棉花茸毛发育机制以及棉花纤维发育机制打下基础。
1材料与方法
1.1 实验材料
沉默目的基因用到的棉花材料为前期茸毛基因定位时的多毛亲本T586，及本实验室长期保存的多茸品系72、8182、121。无毛亲本海岛棉Hai7124为对照材料。
1.2 实验方法
1.2.1 材料培养 把棉花种子浸泡在超纯水中，28℃，过夜至露白；将蛭石和营养土2:1混合，用一次性纸杯盛满，浇透水，将种子放入，覆满土，光照周期16/8h，白天温度28℃，晚上26℃；培养8天，至两片子叶展平，备用。
1.2.2 农杆菌感受态制备 农杆菌菌株GV3101接种到含有利福平(Rif, 50μg/ml) LB固体培养基上，于28℃培养2天；挑取一个单菌落（直径23mm），转到含10mlLB（Rif+）培养基的三角瓶中，于28℃，200rpm振荡培养16h；取500μl过夜培养物转到50ml LB 培养基的三角瓶中，28℃，200rpm振荡培养78小时，至 OD=0.40.5；在超净台上将培养液转移到50ml离心管中，4℃，5000rpm， 5min，去上清；用10 ml 0.15 M的NaCl悬浮沉淀；4℃，5000rpm， 5min，去上清；用 1 ml 预冷的20 mM CaCl2溶液悬浮沉淀；每管100μl 分装到1.5ml离心管中，液氮速冻2min，70℃冰箱保存。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.2 方法 3
1.2.1 材料培养3
1.2.2 农杆菌感受态制备3
1.2.3 TRVVIGS载体构建和储藏3
1.2.4 基因沉默处理3
1.2.5 实时荧光定量PCR分析3
2 结果与分析4
2.1 TRVVIGS载体的构建4
2.2注射以及基因沉默后的植物表型变化和分析5
2.3 其他茸毛品种的TRVVIGS结果6
3 讨论 7
致谢7
参考文献7
基于VIGS技术对棉花叶片密生茸毛候选基因（GhT）的功能分析
种子科学与工程学生 米新月
引言
引言：茸毛是植物表皮的凸起，由单细胞或多细胞发育而来。根据植物种类不同，茸毛在植物上的分布也不同，比如叶、茎、叶柄、花瓣、种皮等，大体上分为两类：无腺体茸毛以及有腺体茸毛或称腺毛[1]。许多植物体表都具有茸毛，茸毛在植物的生长和发育中起着重要的作用，可以增强植物抗逆性，包括防紫外线、抗旱性、抗虫性等。
棉花是世界上重要的经济作物，是纺织工业天然纤维的主要来源。棉种叶片及茎秆表面密生茸毛，可以增强其抗虫性及抗旱性。杨国枝[2]等通过形态指标来鉴定花生茎节茸毛与抗旱性的关系从而指出：花生中上部茎节的茸毛密度
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
和抗旱性有关，茎节茸毛密的品种抗旱性强。而棉花茎干和叶片密生茸毛的性状对蚜虫和其他刺吸式口器害虫有较强的抗性，可以有效地减轻害虫危害[3]。美国对棉花多茸毛性状的研究较多，但是埃及是最先利用该性状来培育品种的国家，该国于20世纪40年代就育成多茸毛品种Bathimlol。(前)苏联报道，澳洲棉和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)两种多毛棉花能够抗棉叶螨类和蚜虫。非洲用多毛的棉花品种防治棉叶蝉也取得成功，这和茸毛阻止害虫产卵有关。根据研究，棉花叶片背面中脉上的茸毛长度和叶蝉产卵量呈负相关。中国农科院棉花研究所在20世纪70年代从辽宁辽阳引进多茸毛种质系多毛早3号，经过鉴定，结果表明：该种质系具有明显的抗棉蚜作用。四川省棉花研究所通过将多茸毛的陆海杂种抗蚜材料抗77和拥有亚洲棉(Gossypium arboreum)系统的苏棉1号杂交，经过连续的多代选择后，培育了对棉蚜和棉红蜘蛛有高度抗性的棉花新品种川棉109。中国农科院棉花研究所用中棉所3号培育而来的7259为多茸毛亲本，复合杂交和分系比较，最后育成了具有优良抗蚜性的多茸毛品种中棉所17和中棉所19。顾恒琴[4]等研究表明，多茸毛抗蚜性不仅仅由于叶片茸毛密度大小，更多的是心叶和幼叶叶片背部的茸毛密度及其在叶背上的分布情况。
研究表明，在棉花中，控制茸毛发育的机制跟控制棉花纤维发育的机制存在相似性，研究茸毛的发育机制可以在一定程度上揭示棉花纤维发育的机理。拟南芥上的无腺体茸毛是用来研究细胞分化和模式形成分子机理的极佳实验对象。拟南芥茸毛的产生和分布受到时间和空间的严格控制。在拟南芥营养生长早期，茸毛只分布在莲座叶的近轴面，而在营养生长后期近轴和远轴面都有分布。生殖生长期间，主花序的茎和花上的茸毛数量会逐渐减少。已知超过30个不同的基因控制茸毛的发育过程[5]。大量基因和分子分析表明一个由三大类转录因子组成的网络在茸毛发育过程中发挥着重要的作用，它们分别是：R2R3MYB蛋白，bHLH转录因子，WD40蛋白。这三种转录因子形成一个三聚激活子复合体，MYBbHLHWDR，该复合体正向调控下游目的基因的表达，而这些基因轮流诱导茸毛的形成。单重复R3MYB蛋白是茸毛发育过程中的反向调节因子[5]。
基因功能的激活以及丧失是我们了解基因功能的两条基本途径。基因功能丧失的研究主要是通过敲除基因包括TDNA插入突变，基因重组以及转座子插入或者通过RNA干扰（RNAi）和病毒介导的基因沉默来下调基因的表达水平。病毒诱导的基因沉默（VIGS）是植物对抗病毒入侵时的防御机制之一，可以识别RNA病毒和DNA病毒，然后激发siRNA介导的PTGS降解病毒序列[6]。病毒介导的基因沉默(virusinduced gene silencing, VIGS)是植物体内普遍存在的一种遗传免疫机制，属于转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing, PTGS)。当携带含有内源基因片段的病毒载体侵染寄主植物后，能够激活植物自身的免疫系统；在识别并降解病毒RNA的同时也会产生含内源目的基因的microRNA，这些microRNA与靶基因的mRNA结合，之后被Dicer酶降解，从而使目的基因表达水平下降或功能丧失。根据构建载体的病毒不同分为RNA病毒载体，DNA病毒载体，卫星病毒载体等3类。其中，基于RNA病毒烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）介导的基因沉默（TRVVIGS）应用最为广泛。在棉花中，多个研究机构亦建立起TRVVIGS 技术，并将该技术应用于棉花不同基因的功能研究[710]。
本研究拟对前期克隆到的棉花叶片密生茸毛基因（GhT），构建基因转化的TRVVIGS载体，沉默目的基因研究其功能。希望通过本研究对克隆到的茸毛基因进行进一步的功能研究，为接下来研究棉花茸毛发育机制以及棉花纤维发育机制打下基础。
1材料与方法
1.1 实验材料
沉默目的基因用到的棉花材料为前期茸毛基因定位时的多毛亲本T586，及本实验室长期保存的多茸品系72、8182、121。无毛亲本海岛棉Hai7124为对照材料。
1.2 实验方法
1.2.1 材料培养 把棉花种子浸泡在超纯水中，28℃，过夜至露白；将蛭石和营养土2:1混合，用一次性纸杯盛满，浇透水，将种子放入，覆满土，光照周期16/8h，白天温度28℃，晚上26℃；培养8天，至两片子叶展平，备用。
1.2.2 农杆菌感受态制备 农杆菌菌株GV3101接种到含有利福平(Rif, 50μg/ml) LB固体培养基上，于28℃培养2天；挑取一个单菌落（直径23mm），转到含10mlLB（Rif+）培养基的三角瓶中，于28℃，200rpm振荡培养16h；取500μl过夜培养物转到50ml LB 培养基的三角瓶中，28℃，200rpm振荡培养78小时，至 OD=0.40.5；在超净台上将培养液转移到50ml离心管中，4℃，5000rpm， 5min，去上清；用10 ml 0.15 M的NaCl悬浮沉淀；4℃，5000rpm， 5min，去上清；用 1 ml 预冷的20 mM CaCl2溶液悬浮沉淀；每管100μl 分装到1.5ml离心管中，液氮速冻2min，70℃冰箱保存。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/564.html
