钙粘蛋白在棉铃虫lf256品系bt抗性中的作用
钙粘蛋白（Cadherin）是一类位于细胞膜上的Ca2+离子结合蛋白，在细胞粘连、迁移、细胞骨架组织和形态发生方面具有重要作用。有关研究表明，昆虫中肠上皮细胞膜上的钙粘蛋白是Bt毒素Cry1Ac的受体，它的变异与昆虫对Bt产生抗性有关。本文利用F1筛选获得的田间抗性純合品系LF256，对其抗性水平进行了测定。与敏感品系SCD相比，LF256品系对Cry1Ac活化毒素的抗性倍数为343倍，具有较高的抗性水平。LF256品系与钙粘蛋白r1突变品系SCD-r1的共同系数C值为0.84，证明LF256品系与钙粘蛋白r1突变具有等位基因遗传互补作用。因此我们克隆了LF256品系钙粘蛋白的cDNA全长，并通过与SCD敏感品系的对比，发现基因序列完整，虽然具有多个多肽性位点，但没有保守的突变位点。因而导致LF256品系产生高水平抗性的机理则需要更进一步的研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 供试棉铃虫 3
1.2 主要试剂与仪器设备3
1.2.1 主要试剂3
1.2.2 主要仪器3
1.3 实验方法3
1.3.1 生物测定方法4
1.3.2 等位基因互补性测验4
1.3.3 棉铃虫钙粘蛋白cDNA的克隆4
1.4 数据统计与分析5
2 结果与分析5
2.1 棉铃虫LF256品系抗性水平5
2.2 棉铃虫LF256与钙粘蛋白r1突变遗传互补6
2.3 抗性品系LF256与敏感品系SCD钙粘蛋白基因的克隆7
3 讨论 11
致谢12
参考文献13
钙粘蛋白在棉铃虫LF256品系Bt抗性中的作用
引言
引言
棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）是隶属于鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）的一种世界广布性农业害虫，广泛分布于南北纬50°之间的亚洲、大洋洲、非洲、欧洲和太平洋西南部岛屿（沈晋良和吴益东， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
1995；郭予元，1998）。自20世纪90年代以来在我国连年大发生，并对常用的化学杀虫剂，特别是菊酯类杀虫剂产生了严重的抗药性，对我国主要棉区的棉花生产造成了重大的经济损失。为控制棉铃虫对棉花的危害，人们采取了多种防治措施和方法。我国自1997年转Bt基因棉花商品化以来,种植面积迅猛增加，2011年Bt棉花在我国的种植面积达到390万公顷，占棉花总种植面积的71.5%（James，2011）。转Bt基因抗虫棉的大面积推广种植，在一定程度上缓解了棉铃虫对棉花的严重危害，但也存在一定的问题。我国田间棉铃虫已对Bt 制剂产生抗性，而且发现棉铃虫对Bt 制剂及转Bt杀虫蛋白基因棉花品系间存在交互抗性（沈晋良等，1998），Tabashnik认为美国Helicoverpa zea棉红铃虫对Bt棉花(Cry1Ac，Cry2Ab)已经产生了抗性。而实验室也筛选出许多棉铃虫高抗品系，Akhurst等通过在人工饲料上筛选21代后得到一个对Cry1Ac毒素有300倍抗性的棉铃虫品系(Akhurst et al.，2003)，Xu等也在实验室内对棉铃虫GY品系进行筛选28代后，得到对Cry1Ac毒素有563倍抗性的GYBT品系(Xu et al.，2005)。这些都表明棉铃虫对 Bt 作物仍存在潜在的抗性演化风险。到目前为止，所有与Bt抗性相关的报道中主要有两种方式导致了昆虫对Bt毒素产生抗性，中肠蛋白酶水解毒素改变和毒素受体发生变异。Bt毒素的中肠结合受体发生变异，导致毒素与中肠受体相互作用发生改变是最重要的抗性机理（Pigott和Ellar，2007）。目前，主要的受体包括Cadherin类、APN类、ALP类和ABC转运蛋白。
钙粘蛋白是一类对细胞粘结起决定作用的依赖Ca2+的糖蛋白，在细胞粘连、迁移、细胞骨架组织和形态发生方面具有重要作用。现阶段已证实在棉铃虫中钙粘蛋白是Cry毒素的受体，其中棉铃虫的钙粘蛋白与毒素的结合区域为12171461位(Jurat Fuentes and Valaitis，2005; Wang et al.，2005a)。穿孔模型认为钙粘蛋白与毒素单体结合有利于寡聚体的形成（Gómez等，2002），寡聚体插入细胞膜形成孔洞导致虫体死亡。信号转导模型认为毒素单体与钙粘蛋白结合激活了一个依赖于Mg2+的信号通路，引起细胞凋亡从而导致了虫体死亡。无论哪一种模型，钙粘蛋白与毒素的结合都决定着毒力的发挥。目前已在三种鳞翅目昆虫烟芽夜峨、棉红铃虫和棉铃虫中，发现钙粘蛋白基因突变与 Cry1Ac的抗性相关。在烟芽夜蛾中发现，钙粘蛋白基因的反转录转座子发生了插入突变以后，烟芽夜蛾就会对CrylAc产生抗性。Morin等人从对Cry1Ac高抗的棉红铃虫品系中发现3个钙粘蛋白突变等位基因(r1,r2,r3)：r1等位基因缺失了24bp，导致了8个氨基酸的缺失；r2等位基因缺失了292bp，使得在805位氨基酸出现了一个提前的终止密码子；r3等位基因缺失了126个bp，缺失42个氨基酸。而且通过抗性基因连锁实验证明了这些突变与抗性相关。Xu等(2005)研究发现，棉铃虫对Cry1Ac抗性品系GYBT中发现钙粘蛋白基因的缺失突变导致截短的钙粘蛋白(仅有428个氨基酸)，并通过回交试验证实该突变与抗性紧密连锁。
本研究针对2009年田间F1筛选获得的田间抗性基因的純合品系LF256，生物测定结果表明LF256品系与敏感品系SCD相比有300多倍的抗性；进一步分析确定了LF256品系与钙粘蛋白r1突变品系间有遗传互补作用，即其抗性与钙粘蛋白相关。为明确钙粘蛋白在LF256品系抗性中的作用，故对LF256品系和敏感品系SCD钙粘蛋白的cDNA全长进行了克隆，并进行序列比对，通过上述研究探讨钙粘蛋白在棉铃虫LF256品系Bt抗性中的作用。
1 材料与方法
1．1 供试棉铃虫
敏感品系（SCD）：采自非洲科特迪瓦，在室内不接触任何药剂下连续饲养30年以上（Yang等，2009）。
抗性品系（LF256）：2009年田间F1筛选获得的含田间抗性基因的純合品系。
钙粘蛋白r1突变品系（SCDr1）：通过基因渗透将室内抗性品系GYBT的钙粘蛋白突变基因r1整合进敏感品系SCD，形成近等基因系SCDr1。与SCD相比，SCDr1对Cry1Ac产生400多倍抗性（Yang等，2009）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 供试棉铃虫 3
1.2 主要试剂与仪器设备3
1.2.1 主要试剂3
1.2.2 主要仪器3
1.3 实验方法3
1.3.1 生物测定方法4
1.3.2 等位基因互补性测验4
1.3.3 棉铃虫钙粘蛋白cDNA的克隆4
1.4 数据统计与分析5
2 结果与分析5
2.1 棉铃虫LF256品系抗性水平5
2.2 棉铃虫LF256与钙粘蛋白r1突变遗传互补6
2.3 抗性品系LF256与敏感品系SCD钙粘蛋白基因的克隆7
3 讨论 11
致谢12
参考文献13
钙粘蛋白在棉铃虫LF256品系Bt抗性中的作用
引言
引言
棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）是隶属于鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）的一种世界广布性农业害虫，广泛分布于南北纬50°之间的亚洲、大洋洲、非洲、欧洲和太平洋西南部岛屿（沈晋良和吴益东， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
1995；郭予元，1998）。自20世纪90年代以来在我国连年大发生，并对常用的化学杀虫剂，特别是菊酯类杀虫剂产生了严重的抗药性，对我国主要棉区的棉花生产造成了重大的经济损失。为控制棉铃虫对棉花的危害，人们采取了多种防治措施和方法。我国自1997年转Bt基因棉花商品化以来,种植面积迅猛增加，2011年Bt棉花在我国的种植面积达到390万公顷，占棉花总种植面积的71.5%（James，2011）。转Bt基因抗虫棉的大面积推广种植，在一定程度上缓解了棉铃虫对棉花的严重危害，但也存在一定的问题。我国田间棉铃虫已对Bt 制剂产生抗性，而且发现棉铃虫对Bt 制剂及转Bt杀虫蛋白基因棉花品系间存在交互抗性（沈晋良等，1998），Tabashnik认为美国Helicoverpa zea棉红铃虫对Bt棉花(Cry1Ac，Cry2Ab)已经产生了抗性。而实验室也筛选出许多棉铃虫高抗品系，Akhurst等通过在人工饲料上筛选21代后得到一个对Cry1Ac毒素有300倍抗性的棉铃虫品系(Akhurst et al.，2003)，Xu等也在实验室内对棉铃虫GY品系进行筛选28代后，得到对Cry1Ac毒素有563倍抗性的GYBT品系(Xu et al.，2005)。这些都表明棉铃虫对 Bt 作物仍存在潜在的抗性演化风险。到目前为止，所有与Bt抗性相关的报道中主要有两种方式导致了昆虫对Bt毒素产生抗性，中肠蛋白酶水解毒素改变和毒素受体发生变异。Bt毒素的中肠结合受体发生变异，导致毒素与中肠受体相互作用发生改变是最重要的抗性机理（Pigott和Ellar，2007）。目前，主要的受体包括Cadherin类、APN类、ALP类和ABC转运蛋白。
钙粘蛋白是一类对细胞粘结起决定作用的依赖Ca2+的糖蛋白，在细胞粘连、迁移、细胞骨架组织和形态发生方面具有重要作用。现阶段已证实在棉铃虫中钙粘蛋白是Cry毒素的受体，其中棉铃虫的钙粘蛋白与毒素的结合区域为12171461位(Jurat Fuentes and Valaitis，2005; Wang et al.，2005a)。穿孔模型认为钙粘蛋白与毒素单体结合有利于寡聚体的形成（Gómez等，2002），寡聚体插入细胞膜形成孔洞导致虫体死亡。信号转导模型认为毒素单体与钙粘蛋白结合激活了一个依赖于Mg2+的信号通路，引起细胞凋亡从而导致了虫体死亡。无论哪一种模型，钙粘蛋白与毒素的结合都决定着毒力的发挥。目前已在三种鳞翅目昆虫烟芽夜峨、棉红铃虫和棉铃虫中，发现钙粘蛋白基因突变与 Cry1Ac的抗性相关。在烟芽夜蛾中发现，钙粘蛋白基因的反转录转座子发生了插入突变以后，烟芽夜蛾就会对CrylAc产生抗性。Morin等人从对Cry1Ac高抗的棉红铃虫品系中发现3个钙粘蛋白突变等位基因(r1,r2,r3)：r1等位基因缺失了24bp，导致了8个氨基酸的缺失；r2等位基因缺失了292bp，使得在805位氨基酸出现了一个提前的终止密码子；r3等位基因缺失了126个bp，缺失42个氨基酸。而且通过抗性基因连锁实验证明了这些突变与抗性相关。Xu等(2005)研究发现，棉铃虫对Cry1Ac抗性品系GYBT中发现钙粘蛋白基因的缺失突变导致截短的钙粘蛋白(仅有428个氨基酸)，并通过回交试验证实该突变与抗性紧密连锁。
本研究针对2009年田间F1筛选获得的田间抗性基因的純合品系LF256，生物测定结果表明LF256品系与敏感品系SCD相比有300多倍的抗性；进一步分析确定了LF256品系与钙粘蛋白r1突变品系间有遗传互补作用，即其抗性与钙粘蛋白相关。为明确钙粘蛋白在LF256品系抗性中的作用，故对LF256品系和敏感品系SCD钙粘蛋白的cDNA全长进行了克隆，并进行序列比对，通过上述研究探讨钙粘蛋白在棉铃虫LF256品系Bt抗性中的作用。
1 材料与方法
1．1 供试棉铃虫
敏感品系（SCD）：采自非洲科特迪瓦，在室内不接触任何药剂下连续饲养30年以上（Yang等，2009）。
抗性品系（LF256）：2009年田间F1筛选获得的含田间抗性基因的純合品系。
钙粘蛋白r1突变品系（SCDr1）：通过基因渗透将室内抗性品系GYBT的钙粘蛋白突变基因r1整合进敏感品系SCD，形成近等基因系SCDr1。与SCD相比，SCDr1对Cry1Ac产生400多倍抗性（Yang等，2009）。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/36.html
