大豆疫霉蛋白pp2c磷酸酶活性检测
摘要：G蛋白信号途径在大豆疫霉的侵染过程中起到非常重要的作用。大豆疫霉PsPP2C编码的PP2C蛋白与G蛋白α亚基(PsGPA)互作。因而通过PsPP2C的功能研究可以进一步明确大豆疫霉G蛋白信号途径的调控机制。PsPP2C编码的蛋白经过生物学功能预测是一类丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，可以催化蛋白的去磷酸化作用。我们通过原核表达PsPP2C，利用原钼酸盐：孔雀石绿：磷酸盐形成三聚体显色的方法体外测定了PsPP2C磷酸酶活性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1载体3
1.1.2使用的培养3
1.2方法 3
1.2.1载体构建3
1.2.2蛋白诱导方法3
1.2.3 Western Blot检测目的蛋白4
1.2.4 蛋白磷酸酶活性检测4
1.2.4.1 测试反应组分4
1.2.4.2 制备染料4
1.2.4.3 酶活性测定4
2 结果与分析5
2.1融合His标签的原核表达载体构建5
2.2 融合His标签的PsPP2C的原核表达5
2.3磷酸酶活性测定5
2.3.1标准曲线的绘制6
2.3.2磷酸酶活性检测6
3讨论 7
致谢8
参考文献8
图1 PET32a::HisPsPP2C菌落PCR验证图5
图2 PsPP2C蛋白Western Blot结果图5
图3 磷酸标准曲线6
图4 磷酸酶活性测定结果6
表1 标准曲线吸光度测定值6
大豆疫霉蛋白PP2C磷酸酶活性检测
引言
大豆疫霉是一种十分重要的植物病原物，由其侵染大豆而引起的疫霉根腐病是大豆生产中的毁灭性病害之一 (Tyler, 2007)。G蛋白即异三聚体鸟嘌呤核苷结合蛋白，是在进化中高度保守的古老的蛋白家族，通常是由G(、G(和G(三个不同亚
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
基组成，在细胞信号传导途径中起到重要作用。其中G(亚基能够与鸟嘌呤核苷(GDP/GTP)结合并具有GTP水解酶活性，G(和G(亚基总是结合在一起形成二聚体。通常的情况下，当G(与GDP结合时，(、(和(三个亚基以三聚体的形式存在，而当G(与GTP结合时，则三者分为G(亚基和G((二聚体两部分，分别行使调控作用(Malbon, 2005)。
在植物中，第一个G蛋白(亚基(AtGPA1)于二十世纪九十年代从拟南芥中克隆得到，随后又不断从其他物种基因组中克隆得到G蛋白。通过转基因和基因缺失突变的方法鉴定得到G蛋白在植物各种生理过程中起作用，如气孔的张开/关闭(Chen et al., 2004) 、病原菌防御、氧化压力应答、种子的萌发、苗和根的发育等(Chen et al., 2006)。随后，拟南芥、水稻和其他物种基因组中相继发现了G(和G(基因，G(具有调节根生长、离子通道、气孔开合和对真菌防御能力的功能，并且对拟南芥突变体表型研究发现G(具有调节叶片、花和果实生长的功能(Lease et al., 2001)。G(和G(的缺失突变体除部分与G(相似的表型以外，还在侧根的产生和对真菌防卫反应中具有自身特定的表型。
前期对植物G蛋白的研究，多参照动物G蛋白的研究方法及结果，但二十一世纪初的一些研究却表明，植物与动物具有不同的G蛋白信号调节系统。首先是对拟南芥的RGS基因AtRGS1的研究发现，该基因的N端具有与GPCR相似的7次跨膜结构，C端具有与动物RGS蛋白相同的典型的RGSbox，这种GPCR和RGS蛋白的嵌合体之前从未被报道过(Chen et al., 2003)。另一个证据是2007年Francis Willard组实验发现拟南芥G(亚基能够无需GEF(guanine nucleotide exchange factor)的激活在体外自主地结合GTP(Johnston et al., 2007)。这种自激活性质表明植物G蛋白不需要，因此也不具有GPCRs。从而从生化、结构、进化和计算机分析结果得出一个共同的结论：植物具有一套独特的G蛋白信号调节系统(Jones et al., 2011)。
G蛋白信号途径是一种保守的跨膜信号传导途径，由三个关键的组分构成：位于膜上的G蛋白偶联受体(Gprotein coupled receptor,GPCR)；位于GPCR下游的异三聚体G蛋白；位于膜上或膜内表面的效应器。其中G蛋白为整个途径的核心，起到分子开关的作用，是信号传递的枢纽；GPCR的主要功能是接收胞外信号，并转换成胞内信号传递给下游锚钉于膜上的G蛋白。GPCR通常含有N端在胞外、C端在胞内的7次跨膜结构域，由跨膜穿梭形成的环状结构在信号传递中具有重要作用。当胞外没有信号刺激时，G(结合GDP，G蛋白的三个亚基形成三聚体与GPCR形成复合体，信号通路关闭；当接收胞外信号分子后，GPCR通过胞内环状结构将信号传导给G蛋白，导致G(GDP中的GDP被GTP取代，引起G蛋白构象变化，G(GTP与G((复合体分离，分别与各自下游的效应分子结合，继续传递和放大信号，信号通路呈打开状态。G(自身具有一定的GTP水解酶活性，能够水解GTP使G(GTP回到G(GDP状态，并且G(GDP与G((的结合能力强于与效应分子的亲和力，因此G蛋白能重新回到异三聚体状态，关闭信号通路(Krumins and Gilman, 2006; Yoshikawa et al., 2000)。
而G蛋白信号途径在大豆疫霉对大豆的侵染过程中起到非常重要的作用，实验前期我们通过GST Pulldown的方法确认了G蛋白α亚基(PsGPA)与PsPP2C的互作关系。通过生物学功能预测发现，PsPP2C编码的蛋白是一类丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。
蛋白质的可逆磷酸化存在于所有的生命体中，磷酸化和脱磷酸化通过翻译后的修饰来改变生化酶的活性，从而参与调控各种信号途径(Shi, et al., 2009)。磷酸酶调节蛋白质的脱磷酸化作用，其包括的2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是磷酸酶中重要的一类，最初在酿酒酵母中发现，酿酒酵母中 PP2C对 HOG途径具有负调控的功能，通过直接将 Hog1磷酸化的苏氨酸位点去磷酸化从而抑制该MAPK途径，调控酿酒酵母在渗透胁迫下的反应(SaitoH et al., 2004; Warmka J et al., 2001)。随后PP2C在许多真核生物体内都得到了发现和研究。到目前为止，在人类基因组中发现了大约 15个 PP2C类蛋白，在线虫中约有 8个，果蝇中有10个，而酵母菌中仅有 7个(RuanH H et al., 2006)。而在拟南芥植物中有近 76个，这表明了植物的PP2C较其他的真核生物具有更丰富的多样性(SchweighoferA et al., 2004)。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1载体3
1.1.2使用的培养3
1.2方法 3
1.2.1载体构建3
1.2.2蛋白诱导方法3
1.2.3 Western Blot检测目的蛋白4
1.2.4 蛋白磷酸酶活性检测4
1.2.4.1 测试反应组分4
1.2.4.2 制备染料4
1.2.4.3 酶活性测定4
2 结果与分析5
2.1融合His标签的原核表达载体构建5
2.2 融合His标签的PsPP2C的原核表达5
2.3磷酸酶活性测定5
2.3.1标准曲线的绘制6
2.3.2磷酸酶活性检测6
3讨论 7
致谢8
参考文献8
图1 PET32a::HisPsPP2C菌落PCR验证图5
图2 PsPP2C蛋白Western Blot结果图5
图3 磷酸标准曲线6
图4 磷酸酶活性测定结果6
表1 标准曲线吸光度测定值6
大豆疫霉蛋白PP2C磷酸酶活性检测
引言
大豆疫霉是一种十分重要的植物病原物，由其侵染大豆而引起的疫霉根腐病是大豆生产中的毁灭性病害之一 (Tyler, 2007)。G蛋白即异三聚体鸟嘌呤核苷结合蛋白，是在进化中高度保守的古老的蛋白家族，通常是由G(、G(和G(三个不同亚
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基组成，在细胞信号传导途径中起到重要作用。其中G(亚基能够与鸟嘌呤核苷(GDP/GTP)结合并具有GTP水解酶活性，G(和G(亚基总是结合在一起形成二聚体。通常的情况下，当G(与GDP结合时，(、(和(三个亚基以三聚体的形式存在，而当G(与GTP结合时，则三者分为G(亚基和G((二聚体两部分，分别行使调控作用(Malbon, 2005)。
在植物中，第一个G蛋白(亚基(AtGPA1)于二十世纪九十年代从拟南芥中克隆得到，随后又不断从其他物种基因组中克隆得到G蛋白。通过转基因和基因缺失突变的方法鉴定得到G蛋白在植物各种生理过程中起作用，如气孔的张开/关闭(Chen et al., 2004) 、病原菌防御、氧化压力应答、种子的萌发、苗和根的发育等(Chen et al., 2006)。随后，拟南芥、水稻和其他物种基因组中相继发现了G(和G(基因，G(具有调节根生长、离子通道、气孔开合和对真菌防御能力的功能，并且对拟南芥突变体表型研究发现G(具有调节叶片、花和果实生长的功能(Lease et al., 2001)。G(和G(的缺失突变体除部分与G(相似的表型以外，还在侧根的产生和对真菌防卫反应中具有自身特定的表型。
前期对植物G蛋白的研究，多参照动物G蛋白的研究方法及结果，但二十一世纪初的一些研究却表明，植物与动物具有不同的G蛋白信号调节系统。首先是对拟南芥的RGS基因AtRGS1的研究发现，该基因的N端具有与GPCR相似的7次跨膜结构，C端具有与动物RGS蛋白相同的典型的RGSbox，这种GPCR和RGS蛋白的嵌合体之前从未被报道过(Chen et al., 2003)。另一个证据是2007年Francis Willard组实验发现拟南芥G(亚基能够无需GEF(guanine nucleotide exchange factor)的激活在体外自主地结合GTP(Johnston et al., 2007)。这种自激活性质表明植物G蛋白不需要，因此也不具有GPCRs。从而从生化、结构、进化和计算机分析结果得出一个共同的结论：植物具有一套独特的G蛋白信号调节系统(Jones et al., 2011)。
G蛋白信号途径是一种保守的跨膜信号传导途径，由三个关键的组分构成：位于膜上的G蛋白偶联受体(Gprotein coupled receptor,GPCR)；位于GPCR下游的异三聚体G蛋白；位于膜上或膜内表面的效应器。其中G蛋白为整个途径的核心，起到分子开关的作用，是信号传递的枢纽；GPCR的主要功能是接收胞外信号，并转换成胞内信号传递给下游锚钉于膜上的G蛋白。GPCR通常含有N端在胞外、C端在胞内的7次跨膜结构域，由跨膜穿梭形成的环状结构在信号传递中具有重要作用。当胞外没有信号刺激时，G(结合GDP，G蛋白的三个亚基形成三聚体与GPCR形成复合体，信号通路关闭；当接收胞外信号分子后，GPCR通过胞内环状结构将信号传导给G蛋白，导致G(GDP中的GDP被GTP取代，引起G蛋白构象变化，G(GTP与G((复合体分离，分别与各自下游的效应分子结合，继续传递和放大信号，信号通路呈打开状态。G(自身具有一定的GTP水解酶活性，能够水解GTP使G(GTP回到G(GDP状态，并且G(GDP与G((的结合能力强于与效应分子的亲和力，因此G蛋白能重新回到异三聚体状态，关闭信号通路(Krumins and Gilman, 2006; Yoshikawa et al., 2000)。
而G蛋白信号途径在大豆疫霉对大豆的侵染过程中起到非常重要的作用，实验前期我们通过GST Pulldown的方法确认了G蛋白α亚基(PsGPA)与PsPP2C的互作关系。通过生物学功能预测发现，PsPP2C编码的蛋白是一类丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。
蛋白质的可逆磷酸化存在于所有的生命体中，磷酸化和脱磷酸化通过翻译后的修饰来改变生化酶的活性，从而参与调控各种信号途径(Shi, et al., 2009)。磷酸酶调节蛋白质的脱磷酸化作用，其包括的2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是磷酸酶中重要的一类，最初在酿酒酵母中发现，酿酒酵母中 PP2C对 HOG途径具有负调控的功能，通过直接将 Hog1磷酸化的苏氨酸位点去磷酸化从而抑制该MAPK途径，调控酿酒酵母在渗透胁迫下的反应(SaitoH et al., 2004; Warmka J et al., 2001)。随后PP2C在许多真核生物体内都得到了发现和研究。到目前为止，在人类基因组中发现了大约 15个 PP2C类蛋白，在线虫中约有 8个，果蝇中有10个，而酵母菌中仅有 7个(RuanH H et al., 2006)。而在拟南芥植物中有近 76个，这表明了植物的PP2C较其他的真核生物具有更丰富的多样性(SchweighoferA et al., 2004)。
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