大豆疫霉无毒效应分子avr3b与寄主互作蛋白的筛选
大豆是世界上重要的粮油作物，由大豆疫霉引起的大豆疫霉根腐病是威胁世界大豆生产的主要病害之一，每年给世界的大豆生产带来巨大经济损失。目前研究抗病品种成为防止大豆疫霉的主要措施。大豆疫霉基因组中含有大约350个RXLR-dEER效应蛋白，许多效应分子通过干扰植物的抗病反应而破坏植物的抗病性，但是病原菌与寄主植物互作中的分子靶标并不清楚。含有Rps3b的大豆品种能够识别大豆疫霉无毒基因Avr3b，研究与Avr3b直接互作的蛋白将有助于进一步了解Avr3b是如何与植物互做影响植物的免疫反应。本实验采用酵母双杂交系统筛选与大豆疫霉无毒基因Avr3b直接互作的蛋白，为进一步研究Avr3b干扰植物免疫反应的分子机理打下基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 5
1.2.1大肠杆菌中提取pGBKT7质粒 5
1.2.2目的基因的PCR扩增、回收和酶切 5
1.2.3目的基因片段和质粒的连接 7
1.2.4大肠杆菌的转化7
1.2.5将构建好的载体pGBKT7：：Avr3b转入酵母菌株AH109中7
1.2.6将大豆cDNA文库转入含Avr3b的酵母菌株中7
2结果与分析8
2.1 目的基因扩增8
2.2 pGBKT7质粒酶切结果8
2.3 重组子pGBKT7：：Avr3b验证结果8
2.4 Avr3b互作蛋白筛选结果9
2.5 候选基因的自激活验证9
3讨论 10
致谢10
参考文献11
大豆疫霉无毒基因Avr3b与寄主互作蛋白的筛选
引言
大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一，每年导致全球十几亿美元的直接经济损失[1]。研究大豆疫霉侵染大豆过程中效应分子的作用机制对于进一步揭示在与寄主互作过程中的病原菌的侵染机制非常重要。
大豆疫霉属是一类营半活体营 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
养的病原卵菌，卵菌与真菌具有相似但不完全相同的侵染过程：卵菌一般产生游动孢子，游动孢子接触到寄主植物表面就会吸附到寄主植物表面并萌发产生附着胞，附着胞进一步产生侵入钉穿透寄主细胞防御系统进入寄主细胞后形成吸器，开始短暂的活体营养阶段，之后不断调控寄主细胞的状态，最终杀死寄主细胞发展到死体营养阶段，从而引起病害。病原卵菌与寄主之间的互作符合“基因对基因假说”，在共进化过程中，病原卵菌产生了致病力等方面的分化，而同时寄主植物也产生了不同的鉴别寄主，很多效应分子被某些或者大部分寄主识别克服成为无毒效应分子。无毒效应分子是病原菌分泌到寄主细胞内抑制植物的PTI和ETI，同时又能被寄主抗病基因识别的效应分子称为无毒效应分子（Avr effector gene）[2]。
Flor (1946)在研究亚麻对亚麻锈菌(Melampsora lini Lev.)的小种特异抗性时提出的基因对基因假说(the geneforgene hypothesis)是研究植物与病原互作的理论基础，迄今已被证明至少适合于几十种不同的植物—病原互作系统所致的病害。其基本内容为：病原与其寄主植物的关系分亲和及不亲和两种类型，亲和与不亲和病原分别含毒性基因(Vir)和无毒基因(Avr)，亲和与不亲和寄主分别含感病基因(r)和抗病基因(R)。当携带无毒基因的病原与携带抗病基因的寄主互作时，二者才表现不亲和，即寄主表现抗病；其它情况下，二者表现亲和，即寄主感病。寄主与病原间的非亲和性互作关系取决于病原产生的无毒因子的变异性和寄主对该因子的敏感性，无毒因子通过改变寄主的生理特性而起作用。
目前研究内容主要集中在无毒效应分子（Avr基因）在基因和基因组结构上的特征、进入植物细胞的转运机理以及在植物病害中具有的毒性功能研究，这些将有助于探索植物病原菌Avr基因的起源和进化，明确其在致病过程中的功能，了解无毒基因和抗病基因之间的协同进化机理，从而对近一步认识和防治卵菌病害具有重要意义。
大豆疫霉基因组中有将近400个RxLR效应分子，研究发现效应分子的RxLR motif可以与植物细胞膜上的PI3P结合，帮助效应分子进入寄主细胞内[4]。目前的研究已经发现一些效应分子能够在植物细胞内发挥毒性功能，抑制植物的免疫反应，帮助病原菌的侵染,如Avr1b等能够进入寄主细胞内，抑制植物的防卫反应，从而促进自身的侵入和扩展。但这些大豆疫霉的效应分子在侵染大豆的过程中如何起作用，研究甚少。本实验室通过对大豆疫霉的169个RxLR效应分子进行高通量的筛选，发现其中93个可以抑制植物的抗病反应，11个效应分子能够在大豆和烟草上出发过敏反应，表明多数效应分子都具有抑制植物防卫反应的能力。
由于疫霉菌基因组序列的公布以及基因枪等新技术的广泛使用，十几个疫霉RxLR无毒基因被克隆出来，包括来来自致病疫霉Phytophthora infestans 的PiAvr3a、PiAvr4、PiAvrblb1、PiAvrblb2[5,6,7,8]和来自大豆疫霉Phytophthora sojae 的PsAvr1b、PsAvr1a、PsAvr3a、PsAvr3c、PsAvr4/6、PsAvr3b[9,10,11,12,13]。
大豆疫霉无毒效应分子PsAvr3b能够被含有Rps3b的大豆品种识别，在烟草上瞬时表达PsAvr3b能够促进辣椒疫霉和烟草疫霉的侵染。通过生物信息学分析发现，PsAvr3b具有Nudix水解酶motif，并且通过生物化学的方法证明了PsAvr3b具有Nudix水解酶活性，并证明能够模拟植物防卫反应抑制因子的作用干扰植物的抗病性。Avr3b在无毒菌株和毒性菌株中均存在，但在无毒菌株中的转录水平远远高于毒性菌株[11]。
本实验主要采用酵母双杂交系统[15]筛选与无毒效应分子Avr3b互作的寄主蛋白，这有助于了解Avr3b在侵染过程中发挥毒性功能和被寄主识别的分子机制。
1 材料与方法
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 5
1.2.1大肠杆菌中提取pGBKT7质粒 5
1.2.2目的基因的PCR扩增、回收和酶切 5
1.2.3目的基因片段和质粒的连接 7
1.2.4大肠杆菌的转化7
1.2.5将构建好的载体pGBKT7：：Avr3b转入酵母菌株AH109中7
1.2.6将大豆cDNA文库转入含Avr3b的酵母菌株中7
2结果与分析8
2.1 目的基因扩增8
2.2 pGBKT7质粒酶切结果8
2.3 重组子pGBKT7：：Avr3b验证结果8
2.4 Avr3b互作蛋白筛选结果9
2.5 候选基因的自激活验证9
3讨论 10
致谢10
参考文献11
大豆疫霉无毒基因Avr3b与寄主互作蛋白的筛选
引言
大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一，每年导致全球十几亿美元的直接经济损失[1]。研究大豆疫霉侵染大豆过程中效应分子的作用机制对于进一步揭示在与寄主互作过程中的病原菌的侵染机制非常重要。
大豆疫霉属是一类营半活体营 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
养的病原卵菌，卵菌与真菌具有相似但不完全相同的侵染过程：卵菌一般产生游动孢子，游动孢子接触到寄主植物表面就会吸附到寄主植物表面并萌发产生附着胞，附着胞进一步产生侵入钉穿透寄主细胞防御系统进入寄主细胞后形成吸器，开始短暂的活体营养阶段，之后不断调控寄主细胞的状态，最终杀死寄主细胞发展到死体营养阶段，从而引起病害。病原卵菌与寄主之间的互作符合“基因对基因假说”，在共进化过程中，病原卵菌产生了致病力等方面的分化，而同时寄主植物也产生了不同的鉴别寄主，很多效应分子被某些或者大部分寄主识别克服成为无毒效应分子。无毒效应分子是病原菌分泌到寄主细胞内抑制植物的PTI和ETI，同时又能被寄主抗病基因识别的效应分子称为无毒效应分子（Avr effector gene）[2]。
Flor (1946)在研究亚麻对亚麻锈菌(Melampsora lini Lev.)的小种特异抗性时提出的基因对基因假说(the geneforgene hypothesis)是研究植物与病原互作的理论基础，迄今已被证明至少适合于几十种不同的植物—病原互作系统所致的病害。其基本内容为：病原与其寄主植物的关系分亲和及不亲和两种类型，亲和与不亲和病原分别含毒性基因(Vir)和无毒基因(Avr)，亲和与不亲和寄主分别含感病基因(r)和抗病基因(R)。当携带无毒基因的病原与携带抗病基因的寄主互作时，二者才表现不亲和，即寄主表现抗病；其它情况下，二者表现亲和，即寄主感病。寄主与病原间的非亲和性互作关系取决于病原产生的无毒因子的变异性和寄主对该因子的敏感性，无毒因子通过改变寄主的生理特性而起作用。
目前研究内容主要集中在无毒效应分子（Avr基因）在基因和基因组结构上的特征、进入植物细胞的转运机理以及在植物病害中具有的毒性功能研究，这些将有助于探索植物病原菌Avr基因的起源和进化，明确其在致病过程中的功能，了解无毒基因和抗病基因之间的协同进化机理，从而对近一步认识和防治卵菌病害具有重要意义。
大豆疫霉基因组中有将近400个RxLR效应分子，研究发现效应分子的RxLR motif可以与植物细胞膜上的PI3P结合，帮助效应分子进入寄主细胞内[4]。目前的研究已经发现一些效应分子能够在植物细胞内发挥毒性功能，抑制植物的免疫反应，帮助病原菌的侵染,如Avr1b等能够进入寄主细胞内，抑制植物的防卫反应，从而促进自身的侵入和扩展。但这些大豆疫霉的效应分子在侵染大豆的过程中如何起作用，研究甚少。本实验室通过对大豆疫霉的169个RxLR效应分子进行高通量的筛选，发现其中93个可以抑制植物的抗病反应，11个效应分子能够在大豆和烟草上出发过敏反应，表明多数效应分子都具有抑制植物防卫反应的能力。
由于疫霉菌基因组序列的公布以及基因枪等新技术的广泛使用，十几个疫霉RxLR无毒基因被克隆出来，包括来来自致病疫霉Phytophthora infestans 的PiAvr3a、PiAvr4、PiAvrblb1、PiAvrblb2[5,6,7,8]和来自大豆疫霉Phytophthora sojae 的PsAvr1b、PsAvr1a、PsAvr3a、PsAvr3c、PsAvr4/6、PsAvr3b[9,10,11,12,13]。
大豆疫霉无毒效应分子PsAvr3b能够被含有Rps3b的大豆品种识别，在烟草上瞬时表达PsAvr3b能够促进辣椒疫霉和烟草疫霉的侵染。通过生物信息学分析发现，PsAvr3b具有Nudix水解酶motif，并且通过生物化学的方法证明了PsAvr3b具有Nudix水解酶活性，并证明能够模拟植物防卫反应抑制因子的作用干扰植物的抗病性。Avr3b在无毒菌株和毒性菌株中均存在，但在无毒菌株中的转录水平远远高于毒性菌株[11]。
本实验主要采用酵母双杂交系统[15]筛选与无毒效应分子Avr3b互作的寄主蛋白，这有助于了解Avr3b在侵染过程中发挥毒性功能和被寄主识别的分子机制。
1 材料与方法
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