产spothriolide类化合物的内生菌nodulispiumsp.a21发酵条件优化
植物内生真菌一般是指生活在植物组织体内的一类并不引起明显病害症状的真菌，对内生真菌次级代谢产物的研究对于新药先导结构的发现具有重要意义。本课题组前期从银杏叶片中获得一株多节孢属内生真菌Nodulispium sp. A21，并从其次级代谢物中分离得到活性化合物spothriolide。该化合物spothriolide对水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、水稻稻瘟病菌等植物病原菌具有较强的抑制活性。为了获得较多的spothriolide进行深入研究，本论文对菌株A21的液体发酵条件进行优化。经过液体培养基、碳源、氮源、发酵天数及环境因子的优化，结果得出产生spothriolide的最佳发酵条件是PD培养基、温度22℃、装液量150mL/250mL瓶、初始PH为8、发酵天数12天。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株来源2
1.1.2 培养基2
1.1.3 主要仪器设备2
1.2 实验方法 2
1.2.1 内生真菌发酵液（FB）制备 2
1.2.2 菌株Nodulispium sp. A21不同有机溶剂提取物的制备2
1.2.3 菌株Nodulispium sp. A21发酵条件优化3
2 结果与分析4
2.1 化合物Nodulispium sp. A21定性定量检测4
2.2 最佳基础培养基4
2.3 最佳碳源5
2.4 最佳氮源6
2.5 最佳发酵时间7
2.6最佳装液量、最适生长温度及最佳初始pH8
3 小结与讨论12
致谢 13
参考文献 13
附录 14
产spothriolide类化合物的内生菌Nodulispium sp. A21发酵条件优化
引言
植物内生真菌一般是指生活在植物组织体内的一类并不引起明显病害症状的真菌，它是一个庞大的特殊真菌类群，几乎所有的植物组织中都发现有 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
内生真菌的存在[1]。内生真菌与宿主植物及其各种天敌之间在长期共进化的过程中形成了密切而又错综复杂的生态关系，而维持这种关系的物质基础是内生菌产生的和(或)由其诱导宿主植物合成的次生代谢产物[2]。内生真菌次生代谢产物的化学结构多样性，在农业和医药业中具有重要的应用潜力。
自1898 年Vogl从黑麦草(Lolium temulentum L.)种子内分离出第一株内生真菌以来，关于内生真菌的研究已有100 多年的历史[3]。植物内生真菌能够产生丰富多样的具有多种生物活性的次生代谢产物[4]，如植物生长调节、杀虫、抑菌、抗肿瘤活性物质等[57]。近年来, 人们在药用植物内生真菌的次级代谢产物中陆续发现了如紫杉醇、大黄素等与宿主的次级代谢产物具有相同或相似结构的化合物[8],使内生真菌代谢产物中活性物质多样性以及与宿主植物互作关系的研究受到广泛关注。
多节孢属(Nodulisporium) 真菌属子囊菌门（Ascomycota）粪壳菌纲（Sordariomycetes）炭角菌目（Xylariales）炭角菌科（Xylariaceae）[9]。该属次生代谢产物化学结构多样，有些具有显著的生物活性，如吲哚类生物碱球孢子酸A（nodulisporic acid A）对埃及伊蚊和丝光绿蝇具有很好的抑制作用[10]。
本课题从银杏叶片中分离得到内生菌Nodulispium sp. A21，它可产生具有活性的天然产物sporothriolide，对水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、水稻稻瘟病菌等植物病原菌具有较强的抑制活性[11]。另据报道，该化合物还可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、小球藻等多种细菌及除草的活性[12]。然而，目前该菌株发酵物中spothriolide类化合物含量较低，无法满足进一步活性测试与机理研究的需要。优化植物内生真菌液体发酵条件可以更好的进行植物内生真菌发酵，利用内生真菌发酵可实现生物活性物质的工业化生产,可以提高活性物质产量、降低产品成本。因此，本课题对影响发酵代谢的各种参数进行了研究，通过发酵条件优化确定最佳发酵培养基配方和最佳发酵条件以提高化合物sporothriolide的产量，为该菌株的综合利用提供重要的基础信息，为大量富集活性化合物，进行深入研究奠定基础。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
大学植物保护学院天然药物化学实验室保存的银杏内生真菌菌种库
1.1.2 培养基
PDA：葡萄糖20g、马铃薯200g、琼脂20g、水1000mL。
PD：葡萄糖20g、马铃薯200g、水1000mL。
CD（察氏）：NaNO3 3g，K2HPO3 1 g， MgSO4?7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4 0.01g, 蔗糖30 g，水1000 mL。
SD（沙氏）：蛋白胨10 g，麦芽糖40 g，水1000 mL。
YMG：酵母膏4g、麦芽膏10g、葡萄糖4g，水1000 mL。
GYT培养基：葡萄糖5 g，蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，牛肉浸膏0.5 g，水1000 mL。
1.1.3 主要仪器设备
高压蒸汽灭菌锅 TOMY SX500 日本
旋转蒸发仪 EYELA N1100 日本
超净工作台 AIRTECH SWCJ1F 江苏苏净集团
恒温培养箱 SPX128 宁波江南仪器厂
摇床 QYC2102C 宁波江南仪器厂
HPLC Aglient 1200 美国
1.2 实验方法
1.2.1内生真菌发酵液（FB）制备
用0.5 cm打孔器将经活化的内生真菌制成菌饼，接种于液体培养基中（150mL PD/250mL三角瓶，10菌饼/瓶），25±1°C、150 rpm摇瓶黑暗培养12 d，至有大量菌丝球出现，经100目尼龙网过滤得发酵液。
1.2.2菌株Nodulispium sp. A21不同有机溶剂提取物的制备
菌株Nodulispium sp. A21发酵液分别用石油醚萃取3次，浓缩蒸干，得到菌株发酵液石油醚相粗体物，4°C保存。
1.2.3 菌株Nodulispium sp. A21发酵条件优化
以重要的代谢产物sporothriolide产量为指导，优化菌株Nodulispium sp. A21的发酵条件。
1.2.3.1高效液相色谱（HPLC）法测定sporothriolide含量
样品处理：不同发酵条件下的发酵液用石油醚萃取3次，浓缩蒸干，得到菌株发酵液石油醚萃取物，4°C保存待测。称取一定量的粗体物，用甲醇配置成浓度为1000μg/mL的溶液。液相条件：甲醇：水=70:30 ，流速：0.6mL/min，检测波长220nm。
标准物质定性及标准曲线测定：按以上液相条件，对sporothriolide进行定性研究。将sporothriolide分别配制浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL的标准溶液，用峰面积与浓度进行线性回归制成标准曲线。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株来源2
1.1.2 培养基2
1.1.3 主要仪器设备2
1.2 实验方法 2
1.2.1 内生真菌发酵液（FB）制备 2
1.2.2 菌株Nodulispium sp. A21不同有机溶剂提取物的制备2
1.2.3 菌株Nodulispium sp. A21发酵条件优化3
2 结果与分析4
2.1 化合物Nodulispium sp. A21定性定量检测4
2.2 最佳基础培养基4
2.3 最佳碳源5
2.4 最佳氮源6
2.5 最佳发酵时间7
2.6最佳装液量、最适生长温度及最佳初始pH8
3 小结与讨论12
致谢 13
参考文献 13
附录 14
产spothriolide类化合物的内生菌Nodulispium sp. A21发酵条件优化
引言
植物内生真菌一般是指生活在植物组织体内的一类并不引起明显病害症状的真菌，它是一个庞大的特殊真菌类群，几乎所有的植物组织中都发现有 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
内生真菌的存在[1]。内生真菌与宿主植物及其各种天敌之间在长期共进化的过程中形成了密切而又错综复杂的生态关系，而维持这种关系的物质基础是内生菌产生的和(或)由其诱导宿主植物合成的次生代谢产物[2]。内生真菌次生代谢产物的化学结构多样性，在农业和医药业中具有重要的应用潜力。
自1898 年Vogl从黑麦草(Lolium temulentum L.)种子内分离出第一株内生真菌以来，关于内生真菌的研究已有100 多年的历史[3]。植物内生真菌能够产生丰富多样的具有多种生物活性的次生代谢产物[4]，如植物生长调节、杀虫、抑菌、抗肿瘤活性物质等[57]。近年来, 人们在药用植物内生真菌的次级代谢产物中陆续发现了如紫杉醇、大黄素等与宿主的次级代谢产物具有相同或相似结构的化合物[8],使内生真菌代谢产物中活性物质多样性以及与宿主植物互作关系的研究受到广泛关注。
多节孢属(Nodulisporium) 真菌属子囊菌门（Ascomycota）粪壳菌纲（Sordariomycetes）炭角菌目（Xylariales）炭角菌科（Xylariaceae）[9]。该属次生代谢产物化学结构多样，有些具有显著的生物活性，如吲哚类生物碱球孢子酸A（nodulisporic acid A）对埃及伊蚊和丝光绿蝇具有很好的抑制作用[10]。
本课题从银杏叶片中分离得到内生菌Nodulispium sp. A21，它可产生具有活性的天然产物sporothriolide，对水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、水稻稻瘟病菌等植物病原菌具有较强的抑制活性[11]。另据报道，该化合物还可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、小球藻等多种细菌及除草的活性[12]。然而，目前该菌株发酵物中spothriolide类化合物含量较低，无法满足进一步活性测试与机理研究的需要。优化植物内生真菌液体发酵条件可以更好的进行植物内生真菌发酵，利用内生真菌发酵可实现生物活性物质的工业化生产,可以提高活性物质产量、降低产品成本。因此，本课题对影响发酵代谢的各种参数进行了研究，通过发酵条件优化确定最佳发酵培养基配方和最佳发酵条件以提高化合物sporothriolide的产量，为该菌株的综合利用提供重要的基础信息，为大量富集活性化合物，进行深入研究奠定基础。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
大学植物保护学院天然药物化学实验室保存的银杏内生真菌菌种库
1.1.2 培养基
PDA：葡萄糖20g、马铃薯200g、琼脂20g、水1000mL。
PD：葡萄糖20g、马铃薯200g、水1000mL。
CD（察氏）：NaNO3 3g，K2HPO3 1 g， MgSO4?7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4 0.01g, 蔗糖30 g，水1000 mL。
SD（沙氏）：蛋白胨10 g，麦芽糖40 g，水1000 mL。
YMG：酵母膏4g、麦芽膏10g、葡萄糖4g，水1000 mL。
GYT培养基：葡萄糖5 g，蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，牛肉浸膏0.5 g，水1000 mL。
1.1.3 主要仪器设备
高压蒸汽灭菌锅 TOMY SX500 日本
旋转蒸发仪 EYELA N1100 日本
超净工作台 AIRTECH SWCJ1F 江苏苏净集团
恒温培养箱 SPX128 宁波江南仪器厂
摇床 QYC2102C 宁波江南仪器厂
HPLC Aglient 1200 美国
1.2 实验方法
1.2.1内生真菌发酵液（FB）制备
用0.5 cm打孔器将经活化的内生真菌制成菌饼，接种于液体培养基中（150mL PD/250mL三角瓶，10菌饼/瓶），25±1°C、150 rpm摇瓶黑暗培养12 d，至有大量菌丝球出现，经100目尼龙网过滤得发酵液。
1.2.2菌株Nodulispium sp. A21不同有机溶剂提取物的制备
菌株Nodulispium sp. A21发酵液分别用石油醚萃取3次，浓缩蒸干，得到菌株发酵液石油醚相粗体物，4°C保存。
1.2.3 菌株Nodulispium sp. A21发酵条件优化
以重要的代谢产物sporothriolide产量为指导，优化菌株Nodulispium sp. A21的发酵条件。
1.2.3.1高效液相色谱（HPLC）法测定sporothriolide含量
样品处理：不同发酵条件下的发酵液用石油醚萃取3次，浓缩蒸干，得到菌株发酵液石油醚萃取物，4°C保存待测。称取一定量的粗体物，用甲醇配置成浓度为1000μg/mL的溶液。液相条件：甲醇：水=70:30 ，流速：0.6mL/min，检测波长220nm。
标准物质定性及标准曲线测定：按以上液相条件，对sporothriolide进行定性研究。将sporothriolide分别配制浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL的标准溶液，用峰面积与浓度进行线性回归制成标准曲线。
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