甜菜夜蛾p450基因上游调控序列分析
昆虫体内P450介导的杀虫剂代谢解毒作用的增强是昆虫产生抗药性的重要机制。其中P450酶量的增加是对杀虫剂代谢解毒能力增强的主要原因。近年来的研究表明抗性相关的P450酶量的增加可能是基因转录过程中一种或多种调控因子共同调控的结果。在本研究中，我们通过荧光定量PCR技术检测甜菜夜蛾中CYP450基因在田间抗性品系中的表达量，结果表明CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1和CYP6AE10在抗性品系中有50～100倍的高表达，我们推断这4个CYP450 基因有可能与甜菜夜蛾对多种杀虫剂的抗性有关。以甜菜夜蛾的基因组为模板，我们克隆得到了这4个CYP450基因5’侧翼序列1600～2200bp的序列，经过软件和网站预测，得到这4个不同基因可能存在的转录起始位点和转录因子的结合位点。通过本实验中的预测的结果，有助我们对甜菜夜蛾CYP450基因在田间抗性品系中的高表达提供分子学依据，进而对甜菜夜蛾解毒酶的抗性机理提供理论依据。关键字细胞色素P450；组成型表达；顺式作用元件；调控机制Upstream regulatory sequence analysis of P450 gene of Beet armywormStudent majoring in college of plant protection Wang ShuaishuaiTutor Jianya SuAbstractP450 mediated pesticide metabolism in the body by an insect detoxification enhancement is a common and important mechanism of insect resistance. Including the increased amount of P450 enzymes is the main reason to the insecticide detoxification metabolism ability enhancement. In recent years, the research shows that resistance related to the increased amount of P450 enzymes may be cis or tra *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
ns factors in the process of gene transcription, or cis and trans factors jointly control results. Therefore in this study, we through the fluorescence quantitative PCR technology in the detection of beet armyworm CYP450 gene expression quantity of resistant strains in the fields. The results showed that CYP321A8, CYP321A16, CYP332A1 and CYP6AE10 50 ~ 100 times in the resistant strain of high expression. We infer that the four CYP450 gene may be associated with resistance to a variety of pesticides in beet armyworm. Use of beet armyworm genome as a template, We got the four CYP450 gene cloning 5 flanking sequences of 1600 ~ 2200 bp sequence. After a software and web site prediction, We got the 4 different genes possible transcription start site and transcription factor binding sites. By the results of prediction in this experiment, will help us to beet armyworm CYP450 gene resistant strains in the field of high expression provides a molecular basis. Then the resistance mechanism of beet armyworm detoxifying enzymes provides theory basis.Key words:CYP450; constitutive expression; cis-acting element; regulatory mechanism前言自从人类第一次发现害虫对化学药剂产生抗药性以来，已有近千种害虫对各种化学药剂产生了抗性。使用化学农药导致的昆虫抗药性问题，已经成为控制害虫（农业害虫和卫生害虫）的一大障碍。由害虫抗药性引发的用药剂量和用药次数的不断增加导致了一系列问题的发生，如食品安全、环境污染、防虫投入成本增加、虫煤疾病的流行等给人类生产生活造成了巨大的损失。由细胞色素P450介导的昆虫抗药性直接影响到杀虫剂对昆虫选择性以及昆虫对杀虫剂的耐受性[1]。对某药剂产生抗性的昆虫通过P450酶代谢和降解杀虫剂的有效成分，使此杀虫剂在昆虫体内失活，这是P450介导抗性的化学本质[2]。P450酶量的增加是昆虫抗药性增强的主要原因,而P450基因的过量表达是P450酶量增加的主要原因，因此掌握P450基因表达与调控机制，从源头揭示P450基因介导抗性的奥秘，可以使害虫的抗性问题得到有效的解决方案。细胞色素P450在整个酶系的末端起氧化作用，典型反应是将一分子氧还原的同时，将一个氧原子转移至底物[3]。 P450酶底物具有多样性，意味着其能催化多种生化反应，除氧化反应外，还可参与羟基化、脱硫化、脱烷基化、脱氢和水解等60多种类型的反应[4]。 细胞色素P450是个庞大的家族，其多样性的根本原因是其基因结构的多样性。除个别情况外，一种P450基因只能产生一种P450蛋白[5]。自1965年研究首次发现昆虫体内的P450以来[6]，昆虫P450研究的速度正快速发展，各种细胞色素P450基因不断被发现。但研究主要集中在农林害虫和卫生害虫少数几个目的昆虫上面，对其他目昆虫P450的研究还需进一步加强［7］。细胞色素P450酶系由多种细胞色素和还原酶以及其他成分组成，其中最重要的是细胞色素P450和细胞色素P450还原酶。细胞色素P450是酶系的末端氧化酶，底物和产物的特异性主要由其决定，更是酶系的重要结构部分[8]。在P450超基因家族在具有高度的变异性的同时，主要功能区也保有较高的同源性[9]。到目前为止，研究发现的昆虫P450的功能有两种催化昆虫体内源性物质的生物合成和降解，调节昆虫的生长、发育和生殖过程[10,11]；代谢外源性物质，使得昆虫对化学药剂产生抗药性，并且使昆虫增强对宿主植物的适应[12]。 昆虫P450细胞色素能够被多种外源性物质所诱导。在昆虫P450的调控方面前人已经作出过详细的论述。目前已经发现多种造成P450基因过量表达的调控机制，这些调控机制均已得到验证 [13]。P450介导昆虫抗性的可能机制包括P450的过量表达和P450氨基酸残基的改变。而调控基因的突变导致的P450的过量表达可能是P450介导抗性的主要机制[14]。 昆虫细胞色素P450基因功能的表达与调控是P450研究的重要内容之一。其表达调控是生物体内外许多种因素相互作用的结果。在基因水平上的最主要的调控环节为基因激活和转录调节。而顺式作用元件和反式作用因子则是基因转录的调控两个关键因素[15]。调控通过改变转录因子直接影响转录，也可改变转录抑制因子间接的影响转录，或者在转录后改变mRNA的稳定性使转录异常 [16]。目前为止，昆虫P450的表达调控机制在有关昆虫抗药性方面一直是研究的热点，在分子水平上还没有充分直接的的有力证据。只有对基因表达调控的分子机制有了细致入微的了解，才能真正揭示昆虫抗药性的分子基础,对于抗性昆虫的治理和防止昆虫产生抗药性才能真正起到帮助。1 材料与方法1.1供试昆虫甜菜夜蛾敏感品系由武汉科诺生物技术有限公司提供，在未接触任何药剂的条件下在室内饲养至今，室内高效氯氟氰菊酯抗性品系于2016年10月采自广东省惠州市，经过室内多代筛选，已产生高抗性。在温度 27℃±2℃，湿度 70%～80%和光周期 16h（L）:8h（D）的光照培养箱中饲养。1.2方法1.2.1 RNA提取选择3头甜菜夜蛾幼虫放入2ml玻璃匀浆器，加入1ml TRIzol (Life technologies)试剂并充分研磨。将研磨液转移至1.5ml离心管中，4℃下12000g离心10min。将上清转移至新的离心管中，加入0.2ml的氯仿，剧烈振荡15s，静置10 min, 4℃下12000 g离心10 min。取上清液转入新的1.5 ml离心管中，加入0.5 ml异丙醇沉淀RNA，充分混匀后，室温下静置10min，4℃下12000 g离心10 min。弃上清液，加入1ml 75%乙醇（RNase-free水配制）洗涤样品，在4℃下7500 × g离心5 min。弃上清液后，室温放置晾干或者置于超净台里吹干（5-10 min），加入适量的Rnase-free水，用枪头吹打使RNA充分溶解。电泳检测提取RNA的完整性，并用分光光度计测定RNA的浓度、纯度和OD260/280值，置于-80℃超低温冰箱保存备用。1.2.2 RT-PCR定量PCR模板采用Vazyme公司的HiScriptII Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)首先去除基因组DNA,将TotalRNA定到500 ng，然后加入SuperMix在25℃ 10min；50℃ 30min；85℃5min条件下进行逆转录反应。1.2.3 定量PCR检测mRNA表达量根据研究中获得的甜菜夜蛾CYP450基因的RNA全长，利用Primer Premier v.5.0软件设计多对引物，并对这些引物进行定量筛选，并选择出一对扩增效率高、特异性好的定量引物，同时选用GAPDH基因为内参（见表1）。本试验采用的荧光染料SYBR GreenⅠ可与所有的双链DNA结合，通过检测反应中SYBR GreenⅠ的荧光强度来反映出PCR产物扩增量。Q-PCR反应采用ABI 7300型荧光定量PCR仪（Applied Biosystems,Foster City,CA）。反应试剂选用康为世纪公司Ultra SYBR Mixture （with ROX），依据说明书在96孔PCR板中依次加入Template cDNA 2 μl、上下游引物各1 μl、2 × UltraSYBR Mixture（With ROX）12.5 μl、RNase-free Water 8.5 μl，共25μl。定量PCR反应程序为95℃ 10min；95℃ 30 s, 60℃ 40s,添加溶解曲线，共40轮。利用Sequence Detection Software Version 1.4(Applied Biosystems)软件进行Ct值的计算、导出与溶解曲线分析。每个模板3次生物学重复，每个cDNA模板三次机械重复。表1 CYP450定量PCR引物表基因正向引物反向引物产物大小(bp)CYP321A8AAACAACCCCAAGACGCATGCCAATGCCAAAGATAGCCCC90CYP321A16GCCGTCGGTATAGGTCAGTTCAATGCTTTCCACTCCTCGG118CYP332A1CTGAAAGATCTTGCCTCGCCTCGGCGATAACTGGAAGGAA110CYP6AE10GGACAATGGTGAAGACTGGCTGCGACAAACTTGAGTGCTC91GAPDHCTGAGGAACAGGTCGTGTCATCGATCGATAACGCGGTTGGAGTA1501.2.4 DNA提取SDS蛋白酶K法提取甜菜夜蛾3龄幼虫基因组由A液（Tris 0.05 mol/L;Nacl 0.1 mol/L;EDTA 0.1mmol/L;pH7.0-8.0）,B液（5%的SDS）,C液（2mg/mL的蛋白酶K）以ABC =811的比例混成基因组提取液，现配现用，取单头3龄幼虫在液氮中研磨后迅速加入0.6 ml的消化液中，消化1-3h后分别用饱和酚和氯仿异丙醇（241）抽提3次，用2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA并用75%的无水乙醇洗涤沉淀，干燥后用分光光度计监测基因组的浓度和纯度，电泳检测其完整性。1.2.5 基因组步移按照Genome Walking Kit (TaKaRa)试剂盒说明书进行，以甜菜夜蛾幼虫为模板，根据已知基因设计3条特异性引物（见表2）。试剂盒中提供的兼并引物与已知基因上的特异性引物进行3轮巢式PCR，回收第 3轮巢式PCR产物，构建至PMD19-T-载体，送至苏州金唯智测序。PCR循环程序如下1st PCR反应程序94℃ 1min;94℃ 30 s;65℃ 1 min;72℃ 2 min94℃ 30 s; 25℃ 3 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 44℃ 1 min; 72℃ 2 min;72℃ 10 min2nd PCR 反应程序94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 44℃ 1 min; 72℃ 2 min;72℃ 10 min3rd PCR 反应程序94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 44℃ 1 min; 72℃ 2 min;72℃ 10 min表2 CYP450基因染色体步移的克隆引物引物编号引物序列（5-3)321A8-1-GSP3CTATGAAATAGTCCCAGTAAGGTCCA321A8-1-GSP2CGGTTCATGTCTGTACTTCTTGTACA321A8-1-GSP1AGTCTCCTGATAGAACCTGCTGCACA321A8-2-GSP3AATCGAGACGATTTGCTTCACGATCT321A8-2-GSP2AAGATGATCTTGAGGAGTCTGATACA321A8-2-GSP1GTTGTTGTAGATCTGCAACAATATGC321A8-3-GSP3TCAAGGACATAATGACTGTCAACAGA321A8-3-GSP2ATGGCGATACTGATATACATGTCTGT321A8-3-GSP1GGAGACACTACATACCCACCAGAACT321A16-1-GSP3GTACAGATCTCCAAAGATCTGGAAC321A16-1-GSP2CATTGCAGGTGTTAAGAACTGACCT321A16-1-GSP1AGTCACCTGATAGAACTTGCTGCAC321A16-2-GSP3AGTCATATTCGATCGCATCAGCTTC321A16-2-GSP2TCTCCTTCAATGCTTTCCACTCCTC321A16-2-GSP1GACCTATACCGACGGCTGGTTCATG321A16-3-GSP3ATCACTTAATTGGTCTCCTTCAATGC321A16-3-GSP2AGTCACCTGATAGAACTTGCTGCACA321A16-3-GSP1CTGACCTATACCGACGGCTGGTTCAT6AE10-1-GSP3TTCCCACAATTGGTTTTGGTGGTAG6AE10-1-GSP2TATTACAGATCTCCTGTTCAACGCGG6AE10-1-GSP1CCTTCTCGGAGTATGAGGAGACTTC6AE10-2-GSP3CGACGGTCACAATCACCTTCAATCAC6AE10-2-GSP2GTCCTAAGTCAGAATGAGGCAATCGA6AE10-2-GSP1CCTACAAGCCAAGCCGCAGTATGTCA332A1-1-GSP3CACGCCTCGTTTCTTCCAGTATCCAT332A1-1-GSP2AACACATCCCAGAAGCTCCTCCTCAT332A1-1-GSP1ATGATCATGAGAGCAGGCTTCCATGA332A1-2-GSP3TAGCCGATGCCAATCGGACAGTCAAT332A1-2-GSP2GAATTTTGCACACAGATCTGACGCGT332A1-2-GSP1TGCAACCACCACTTGCAATAGTGCCT1.3 转录因子结合位点预测 点击网址http://alggen.lsi.upc.edu/heading.html进去以后点击ALGGEN进去以后点击PROMOSteep1点击selectspecies,进去以后选定Selected species factors和Selected species sites，首先点击小三角All species，然后点击小三角eukaryota，接着点击小三角animals，点击小三角arthropoda，最后选定小正方形insecta。Sites of选项操作与以上相同。最后点击submit点击selectfactors进去以后选定Predict all factors except these selected，点击submitSteep2，点击searchsites,进去以后直接复制序列，然后提交，显示结果。1.4 统计分析CYP450基因的抗性与敏感之间的相对表达水平以Fold change±SD来表示。利用SPSS19.0软件进行t检验，P<0.05为显著性差异。2 结果与分析2.1 CYP450在田间抗性品系中过表达根据本实验室已经克隆得到的CYP450的核酸序列，我们利用荧光定量PCR技术，对已经得到的68个CYP450基因进行了定量分析（见图1）。结果表明4个CYP450基因（CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1和CYP6AE10）在高效氯氟氰菊脂抗性品系中的表达量与室内敏感品系相比表现出有明显的高表达（无显著变化的没有列出）。其中CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1相对敏感品系有约50倍的表达量的差异，CYP6AE10基因在抗性品系中有大约100倍的高表达。图1 CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1和CYP6AE10在高效氯氟氰菊脂抗性品系中的相对表达量。2.2 CYP450基因上游序列的克隆在本研究中，我们运用SDS-蛋白酶K法提取了甜菜夜蛾敏感品系的基因组，用紫外/可见分光分度计检测到基因组的浓度和纯度，并且使用0.7%的琼脂糖凝胶电泳对基因组的完整度进行鉴定，通过这两种鉴定方法得到的基因组有很好的完整度和较高的丰度。在关于甜菜夜蛾的CYP450基因的上游序列的克隆中，我们以甜菜夜蛾的基因组为模板，其中的上游引物是由试剂盒中提供的AP2，下游引物是采用特异性的引物（SP），进行了巢式PCR，特异性引物的设计原理如图2所示。图2 甜菜夜蛾CYP450基因上游序列的克隆特异性引物设计示意图。CYP321A8和CYP321A16基因在克隆过程中分为3段获得基因序列，得到了上游序列分别为1978和2213bp。CYP6AE10和 CYP332A1基因在克隆过程中分为2段获得基因序列，得到的上游序列的长度分别为1673和2037bp（如表3所示）。表3 甜菜夜蛾CYP450基因上游序列克隆的长度和PCR次数基因获取上游序列(bp)PCR次数CYP321A819783CYP321A1622133CYP6AE1016732CYP332A1203722.3 启动子位点分析表转录位点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应的DNA链上的碱基，研究表明通常为一个嘌呤（A或G）。转录起始位点一般位于TATA盒上游20-30bp的位置，利用启动子位点分析网站Neural Network Promoter Prediction（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html），预测得到了在甜菜夜蛾田间抗性品系中高表达的4个CYP450的5’侧翼序列的转录起预测可能存在的始位点，其转录起始位点上游存在着TATA盒。（见表4）。表4 甜菜夜蛾CYP321A8、CYP321A16、CYP6AE10、CYP332A1 5’侧翼序列可能的转录起始位点CYP450StartEndScorePromoter SequenceCYP321A8-1131-10810.93TTTACAAGTTTATATAGATACCACTGACAAAGAATGAGTGAAATTTGGAC-362-3120.92AAAAAAAGAATATAAACTGTCCGATTTACGAAGAACTAGTACGAATCTCG-40100.98ATATTATATTTATATAAGGTTTGTCAGCTGAAGAAGTAACAAGTGTTTGTCYP321A16-574-5240.82TTTGTCTAGGCACAAAAACCGTCCAAGTGCGAGTCGGCCGAAGGGCTTTC-40100.97AACAGCTGAGTATAAGTACGGCGCGCAATTTACATCTGTATGTTACTTGTCYP6AE10-1061-10510.85CTTTCGTCCTAATAAGAGCGGAAGAAGTCATTGGATGATTTTCACCCCTC-382-3320.83GAAGTTGTATGATTATAACCGCACCCACGACACAGGAGATAGTCCTAGAG-40100.97ATCTAAAGCAGTATAAATACCGAAACAAAGCGGCTACGGCAATCATTCACCYP332A1-150-1000.95ATATTTCTTATATAAATTCGGGACTTGTTTACATTTTTTTATGCCAAGAA-40101GTTGCAAATTTAAAAACTGCCGTCTCACGGTGAGACAGACACGTGTAAAT甜菜夜蛾CYP321A8 5’侧翼序列经预测可能存在3个转录起始位点，CYP321A16 5’侧翼序列可能存在2个转录起始位点，CYP6AE10 5’侧翼序列能存在3个转录起始位点，CYP332A1 5’侧翼序列能存在2个转录起始位点。2.4 转录因子结合位点利用转录因子网站ALGGEN（http://alggen.lsi.upc.edu/）预测得到的结果中（见表5），不仅发现了CYP450基因的5’侧翼序列不仅具有启动子序列必需具有的核心元件TATA框，其中TATA框具有将RNA聚合酶引导到正确转录起始位点的功能，从而使转录精确得开始。同时还具有结合位点Ftz、Zen-1、GAGA factor和Dfd等。其中CYP321A8序列的5’侧翼序列经预测存在22个录因子结合位点，CYP321A16序列的5’侧翼序列经预测得到20个转录因子结合位点，CYP6AE10序列的5’侧翼序列经预测得到22个转录因子结合位点，CYP332A1序列的5’侧翼序列经预测得到25个转录因子结合位点。这些预测得到的的转录因子中，Dfd、Ftz、Prd和Antp等转录因子在这4个CYP450酶的5’侧翼序列中都存在着结合位点，但在得到的结果中每个CYP450 基因中预测得到的转录因子也有不同，如GAGA factor经预测在CYP321A8、CYP6AE10和CYP332A1都存在结合位点，但在CYP321A16不存在该转录因子的结合位点。表5 CYP450上游序列中转录因子结合位点的种类与数量转录因子CYP321A8CYP321A16CYP6AE10CYP332A1Adf-1888Antp13131313B factor?8888Bcd99Dfd8888Dl9999DSXF7777DSXM7777DTF-1111111E2F888E74A1111En11Eve9999Ftz4444GAGA factor888GCM9999Gt11111111Hb7777Kr111111Mad5555Prd7777SGF-311111111Sry-delta13Tll6666Ttk 69K8Zen-19999Zeste7773 讨论昆虫细胞色素P450以多种不同的类型存在于同一生物体内，不同的昆虫的P450基因的数量存在显著的差异，已知基因组的昆虫中P450基因的数量介于36～170种之间。在本文中，我们采用的甜菜夜蛾田间抗性品系在多种杀虫剂表现出了中等到高等的抗性水平。根据本实验已经获得的甜菜夜蛾的CYP450的核酸序列，设计荧光定量引物，利用荧光定量PCR技术检测到的了4个在抗性品系中高表达的CYP450 基因，分别是CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1和CYP6AE10。因此我们推断这4个CYP450 基因可能与甜菜夜蛾对杀虫剂的抗性有关。P450介导的杀虫剂代谢解毒活性增加可以使昆虫对杀虫剂产生抗性。与抗性相关的P450的酶量增加已发现两种机制一是基因组层面上的基因拷贝数的增加，是基因重复或基因扩增的结果；二是基因转录层面上的基因上调表达，受顺式或反式因子、或顺式与反式因子的共同调控[17]。P450调节基因的突变在杀虫剂抗药性中起中心作用。因此在本研究中我们对在甜菜夜蛾中有高表达的4个CYP450 基因的上游的5’侧翼序列进行克隆。在结果我们克隆得到了这4个基因上游1600～2200bp不等的DNA序列，在利用软件或网站对已经获得5’侧翼序列进行预测，其中主要包括对启动子位点和转录因子结合位点的预测。甜菜夜蛾P450的研究目前尚属起步阶段，其抗性相关基因表达调控机制尚未得到验证。本实验是基于分子水平对甜菜夜蛾P450基因进行研究，实验结果为进一步研究甜菜夜蛾P450基因的表达与调控奠定了坚实基础。致 谢感谢实验室师兄胡波博士在日常工作、学习和生活中的大力帮助。实验之初，胡波师兄在其百忙之中一步一步指导我进行实验操作，将其获得的知识倾囊相授。在实验遇到困境时，胡波师兄总能指出问题所在，帮助我将实验顺利进行。在论文写作中，胡波师兄帮助我整理数据，对论文各方面作出指导。谢谢胡波师兄。接下来感谢实验室的魏琪师兄、居晓敏师姐、慕希超师兄、任淼淼师姐、王利祥师兄、赵佩瑶师兄、赵晨师兄、周丽琪师姐、王世玉师姐、汤雨洁师姐、黄河师兄、钮建国师兄、薛圆师姐、李剑师兄、姜娜娜师姐、曾斌师兄等在生活学习中对我的帮助。感谢班主任黄韶华、辅导员李艳丹和张聪，他们对我本科期间的学习生活产生了重要的影响，给我指明了生活就业的方向。感谢各位同学和朋友在日常学习和生活中的支持，尤其是各位舍友的支持与鼓励，谢谢王世杰、黄申、冉启凰、任子奇、谢约翰。感谢我的父母和家人，他们一直都在背后支持鼓励我，是我在学校生活和学习的坚强后盾，同时也是我不断前进的动力。感谢每一个帮助过我的人，谢谢您们！王帅帅2017年4月1日星期六参考文献[1]倪智伟,蒲冠勤.昆虫抗药性机制研究进展[J].江苏蚕业,2006,4:21-23.[2]潘贻武,刘宁,刘小宁.昆虫细胞色素P450的研究进展及其介导的抗药性[J].2007,44(4):470-475.[3]Mansuy D.The great diversity of reactions catalyzed by cytochromes P450[J].Comparative Biochchemistry and Physiology Pan C:Pharmacology, Toxicology and Endocrinology,1998,121:5-14.[4]王燕红. 野桑蚕细胞色素P450基因的克隆、组织表达及其功能研究[D]. 苏州大学. 2009. [5]高瑞娜. 家蚕细胞色素P450的基因表达调控研究[D]. 苏州大学. 2011. [6]冯纪年,田宏刚,郭付振等.昆虫细胞色素P450研究进展[J].昆虫生理生化.2004:200-206.[7]郭亭亭,姜辉昆虫细胞色素P450基因的多样性、进化及表达调控[J].昆虫学报.2009,52(3):301-311.[8]周颖君.棉铃虫细胞色素P450 CYP9A亚家族的表达调控机理及进化关系研究[D].硕士学位论文,南京:大学,2007.[9]丁天波. 柑橘全爪螨细胞色素P450及其相关基因的鉴定和表达模式研究[D].博士学位论文,重庆:西南大学,2016. [10] T D Sutherland，Gopalan C Unnithan．A cytochrome P450 terpenoid hydroxylase linked to the suppression of insect juvenile hormone synthesis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1998,95(22):12884-12889.[11] Jochen Winter，Graeme Bilbe，Hanny Richener,et al.Cloning of a cDNA Encoding a Novel Cytochrome P450 from the Insect Locusta migratoria: CYP6H1, a Putative Ecdysone 20-Hydroxylase[J].Biochemical and Biophysical Research Communications.1999,259(2):305-310. [12] Feyereisen R．Insect P450 enzymes[J].Annual Review of Entomology.1999,44:507-533.[13]Chung H,Bogwitz M R,McCart C,Andrianopoulos A,et a1.Cis-regulatory elements in the Accord retrotransposon result in tissue-specific expression of the Drosophila melanogaster insecticide resistance gene Cyp6g1[J].Genetics,2007,175:1071-1077.[14]Gao J,Scott J G. Role of the transcriptional repressor mdGfi-1 in CYP6D1v1-mediated insecticide resistance in the house fly, Musca domestica[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2006,36:387-395.[15]唐振华.昆虫中的细胞色素P450及其特性[J].昆虫知识,1990,27（1）:52-55.[16]Prapaipong H,Berenbaum M R,Shuler M A. Transcriptional regulation of the Papiliopolyxenes CYP6B1 gene[J].Nucleic Acids Research,1994,22(15):3210-3217.[17]邱星辉,冷欣夫.昆虫细胞色素P450基因的表达与调控及P450介导抗性的分子机制[J].农药学学报,1999,1(1):7-14.
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1RNA提取2
1.2.2RTPCR3
1.2.3定量PCR检测mRNA表达量3
1.2.4DNA提取3
1.2.5基因组步移3
1．3转录因子结合位点预测 5
1.4统计分析 5
2结果与分析5
2.1CYP450在田间抗性品系中过表达5
2.2CYP450基因上游序列的克隆5
2.3启动子位点分析表6
2.4转录因子结合位点6
3讨论 7
致谢9
参考文献10
甜菜夜蛾P450基因上游调控序列分析
ns factors in the process of gene transcription, or cis and trans factors jointly control results. Therefore in this study, we through the fluorescence quantitative PCR technology in the detection of beet armyworm CYP450 gene expression quantity of resistant strains in the fields. The results showed that CYP321A8, CYP321A16, CYP332A1 and CYP6AE10 50 ~ 100 times in the resistant strain of high expression. We infer that the four CYP450 gene may be associated with resistance to a variety of pesticides in beet armyworm. Use of beet armyworm genome as a template, We got the four CYP450 gene cloning 5 flanking sequences of 1600 ~ 2200 bp sequence. After a software and web site prediction, We got the 4 different genes possible transcription start site and transcription factor binding sites. By the results of prediction in this experiment, will help us to beet armyworm CYP450 gene resistant strains in the field of high expression provides a molecular basis. Then the resistance mechanism of beet armyworm detoxifying enzymes provides theory basis.Key words:CYP450; constitutive expression; cis-acting element; regulatory mechanism前言自从人类第一次发现害虫对化学药剂产生抗药性以来，已有近千种害虫对各种化学药剂产生了抗性。使用化学农药导致的昆虫抗药性问题，已经成为控制害虫（农业害虫和卫生害虫）的一大障碍。由害虫抗药性引发的用药剂量和用药次数的不断增加导致了一系列问题的发生，如食品安全、环境污染、防虫投入成本增加、虫煤疾病的流行等给人类生产生活造成了巨大的损失。由细胞色素P450介导的昆虫抗药性直接影响到杀虫剂对昆虫选择性以及昆虫对杀虫剂的耐受性[1]。对某药剂产生抗性的昆虫通过P450酶代谢和降解杀虫剂的有效成分，使此杀虫剂在昆虫体内失活，这是P450介导抗性的化学本质[2]。P450酶量的增加是昆虫抗药性增强的主要原因,而P450基因的过量表达是P450酶量增加的主要原因，因此掌握P450基因表达与调控机制，从源头揭示P450基因介导抗性的奥秘，可以使害虫的抗性问题得到有效的解决方案。细胞色素P450在整个酶系的末端起氧化作用，典型反应是将一分子氧还原的同时，将一个氧原子转移至底物[3]。 P450酶底物具有多样性，意味着其能催化多种生化反应，除氧化反应外，还可参与羟基化、脱硫化、脱烷基化、脱氢和水解等60多种类型的反应[4]。 细胞色素P450是个庞大的家族，其多样性的根本原因是其基因结构的多样性。除个别情况外，一种P450基因只能产生一种P450蛋白[5]。自1965年研究首次发现昆虫体内的P450以来[6]，昆虫P450研究的速度正快速发展，各种细胞色素P450基因不断被发现。但研究主要集中在农林害虫和卫生害虫少数几个目的昆虫上面，对其他目昆虫P450的研究还需进一步加强［7］。细胞色素P450酶系由多种细胞色素和还原酶以及其他成分组成，其中最重要的是细胞色素P450和细胞色素P450还原酶。细胞色素P450是酶系的末端氧化酶，底物和产物的特异性主要由其决定，更是酶系的重要结构部分[8]。在P450超基因家族在具有高度的变异性的同时，主要功能区也保有较高的同源性[9]。到目前为止，研究发现的昆虫P450的功能有两种催化昆虫体内源性物质的生物合成和降解，调节昆虫的生长、发育和生殖过程[10,11]；代谢外源性物质，使得昆虫对化学药剂产生抗药性，并且使昆虫增强对宿主植物的适应[12]。 昆虫P450细胞色素能够被多种外源性物质所诱导。在昆虫P450的调控方面前人已经作出过详细的论述。目前已经发现多种造成P450基因过量表达的调控机制，这些调控机制均已得到验证 [13]。P450介导昆虫抗性的可能机制包括P450的过量表达和P450氨基酸残基的改变。而调控基因的突变导致的P450的过量表达可能是P450介导抗性的主要机制[14]。 昆虫细胞色素P450基因功能的表达与调控是P450研究的重要内容之一。其表达调控是生物体内外许多种因素相互作用的结果。在基因水平上的最主要的调控环节为基因激活和转录调节。而顺式作用元件和反式作用因子则是基因转录的调控两个关键因素[15]。调控通过改变转录因子直接影响转录，也可改变转录抑制因子间接的影响转录，或者在转录后改变mRNA的稳定性使转录异常 [16]。目前为止，昆虫P450的表达调控机制在有关昆虫抗药性方面一直是研究的热点，在分子水平上还没有充分直接的的有力证据。只有对基因表达调控的分子机制有了细致入微的了解，才能真正揭示昆虫抗药性的分子基础,对于抗性昆虫的治理和防止昆虫产生抗药性才能真正起到帮助。1 材料与方法1.1供试昆虫甜菜夜蛾敏感品系由武汉科诺生物技术有限公司提供，在未接触任何药剂的条件下在室内饲养至今，室内高效氯氟氰菊酯抗性品系于2016年10月采自广东省惠州市，经过室内多代筛选，已产生高抗性。在温度 27℃±2℃，湿度 70%～80%和光周期 16h（L）:8h（D）的光照培养箱中饲养。1.2方法1.2.1 RNA提取选择3头甜菜夜蛾幼虫放入2ml玻璃匀浆器，加入1ml TRIzol (Life technologies)试剂并充分研磨。将研磨液转移至1.5ml离心管中，4℃下12000g离心10min。将上清转移至新的离心管中，加入0.2ml的氯仿，剧烈振荡15s，静置10 min, 4℃下12000 g离心10 min。取上清液转入新的1.5 ml离心管中，加入0.5 ml异丙醇沉淀RNA，充分混匀后，室温下静置10min，4℃下12000 g离心10 min。弃上清液，加入1ml 75%乙醇（RNase-free水配制）洗涤样品，在4℃下7500 × g离心5 min。弃上清液后，室温放置晾干或者置于超净台里吹干（5-10 min），加入适量的Rnase-free水，用枪头吹打使RNA充分溶解。电泳检测提取RNA的完整性，并用分光光度计测定RNA的浓度、纯度和OD260/280值，置于-80℃超低温冰箱保存备用。1.2.2 RT-PCR定量PCR模板采用Vazyme公司的HiScriptII Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)首先去除基因组DNA,将TotalRNA定到500 ng，然后加入SuperMix在25℃ 10min；50℃ 30min；85℃5min条件下进行逆转录反应。1.2.3 定量PCR检测mRNA表达量根据研究中获得的甜菜夜蛾CYP450基因的RNA全长，利用Primer Premier v.5.0软件设计多对引物，并对这些引物进行定量筛选，并选择出一对扩增效率高、特异性好的定量引物，同时选用GAPDH基因为内参（见表1）。本试验采用的荧光染料SYBR GreenⅠ可与所有的双链DNA结合，通过检测反应中SYBR GreenⅠ的荧光强度来反映出PCR产物扩增量。Q-PCR反应采用ABI 7300型荧光定量PCR仪（Applied Biosystems,Foster City,CA）。反应试剂选用康为世纪公司Ultra SYBR Mixture （with ROX），依据说明书在96孔PCR板中依次加入Template cDNA 2 μl、上下游引物各1 μl、2 × UltraSYBR Mixture（With ROX）12.5 μl、RNase-free Water 8.5 μl，共25μl。定量PCR反应程序为95℃ 10min；95℃ 30 s, 60℃ 40s,添加溶解曲线，共40轮。利用Sequence Detection Software Version 1.4(Applied Biosystems)软件进行Ct值的计算、导出与溶解曲线分析。每个模板3次生物学重复，每个cDNA模板三次机械重复。表1 CYP450定量PCR引物表基因正向引物反向引物产物大小(bp)CYP321A8AAACAACCCCAAGACGCATGCCAATGCCAAAGATAGCCCC90CYP321A16GCCGTCGGTATAGGTCAGTTCAATGCTTTCCACTCCTCGG118CYP332A1CTGAAAGATCTTGCCTCGCCTCGGCGATAACTGGAAGGAA110CYP6AE10GGACAATGGTGAAGACTGGCTGCGACAAACTTGAGTGCTC91GAPDHCTGAGGAACAGGTCGTGTCATCGATCGATAACGCGGTTGGAGTA1501.2.4 DNA提取SDS蛋白酶K法提取甜菜夜蛾3龄幼虫基因组由A液（Tris 0.05 mol/L;Nacl 0.1 mol/L;EDTA 0.1mmol/L;pH7.0-8.0）,B液（5%的SDS）,C液（2mg/mL的蛋白酶K）以ABC =811的比例混成基因组提取液，现配现用，取单头3龄幼虫在液氮中研磨后迅速加入0.6 ml的消化液中，消化1-3h后分别用饱和酚和氯仿异丙醇（241）抽提3次，用2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA并用75%的无水乙醇洗涤沉淀，干燥后用分光光度计监测基因组的浓度和纯度，电泳检测其完整性。1.2.5 基因组步移按照Genome Walking Kit (TaKaRa)试剂盒说明书进行，以甜菜夜蛾幼虫为模板，根据已知基因设计3条特异性引物（见表2）。试剂盒中提供的兼并引物与已知基因上的特异性引物进行3轮巢式PCR，回收第 3轮巢式PCR产物，构建至PMD19-T-载体，送至苏州金唯智测序。PCR循环程序如下1st PCR反应程序94℃ 1min;94℃ 30 s;65℃ 1 min;72℃ 2 min94℃ 30 s; 25℃ 3 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 44℃ 1 min; 72℃ 2 min;72℃ 10 min2nd PCR 反应程序94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 44℃ 1 min; 72℃ 2 min;72℃ 10 min3rd PCR 反应程序94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 62℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 44℃ 1 min; 72℃ 2 min;72℃ 10 min表2 CYP450基因染色体步移的克隆引物引物编号引物序列（5-3)321A8-1-GSP3CTATGAAATAGTCCCAGTAAGGTCCA321A8-1-GSP2CGGTTCATGTCTGTACTTCTTGTACA321A8-1-GSP1AGTCTCCTGATAGAACCTGCTGCACA321A8-2-GSP3AATCGAGACGATTTGCTTCACGATCT321A8-2-GSP2AAGATGATCTTGAGGAGTCTGATACA321A8-2-GSP1GTTGTTGTAGATCTGCAACAATATGC321A8-3-GSP3TCAAGGACATAATGACTGTCAACAGA321A8-3-GSP2ATGGCGATACTGATATACATGTCTGT321A8-3-GSP1GGAGACACTACATACCCACCAGAACT321A16-1-GSP3GTACAGATCTCCAAAGATCTGGAAC321A16-1-GSP2CATTGCAGGTGTTAAGAACTGACCT321A16-1-GSP1AGTCACCTGATAGAACTTGCTGCAC321A16-2-GSP3AGTCATATTCGATCGCATCAGCTTC321A16-2-GSP2TCTCCTTCAATGCTTTCCACTCCTC321A16-2-GSP1GACCTATACCGACGGCTGGTTCATG321A16-3-GSP3ATCACTTAATTGGTCTCCTTCAATGC321A16-3-GSP2AGTCACCTGATAGAACTTGCTGCACA321A16-3-GSP1CTGACCTATACCGACGGCTGGTTCAT6AE10-1-GSP3TTCCCACAATTGGTTTTGGTGGTAG6AE10-1-GSP2TATTACAGATCTCCTGTTCAACGCGG6AE10-1-GSP1CCTTCTCGGAGTATGAGGAGACTTC6AE10-2-GSP3CGACGGTCACAATCACCTTCAATCAC6AE10-2-GSP2GTCCTAAGTCAGAATGAGGCAATCGA6AE10-2-GSP1CCTACAAGCCAAGCCGCAGTATGTCA332A1-1-GSP3CACGCCTCGTTTCTTCCAGTATCCAT332A1-1-GSP2AACACATCCCAGAAGCTCCTCCTCAT332A1-1-GSP1ATGATCATGAGAGCAGGCTTCCATGA332A1-2-GSP3TAGCCGATGCCAATCGGACAGTCAAT332A1-2-GSP2GAATTTTGCACACAGATCTGACGCGT332A1-2-GSP1TGCAACCACCACTTGCAATAGTGCCT1.3 转录因子结合位点预测 点击网址http://alggen.lsi.upc.edu/heading.html进去以后点击ALGGEN进去以后点击PROMOSteep1点击selectspecies,进去以后选定Selected species factors和Selected species sites，首先点击小三角All species，然后点击小三角eukaryota，接着点击小三角animals，点击小三角arthropoda，最后选定小正方形insecta。Sites of选项操作与以上相同。最后点击submit点击selectfactors进去以后选定Predict all factors except these selected，点击submitSteep2，点击searchsites,进去以后直接复制序列，然后提交，显示结果。1.4 统计分析CYP450基因的抗性与敏感之间的相对表达水平以Fold change±SD来表示。利用SPSS19.0软件进行t检验，P<0.05为显著性差异。2 结果与分析2.1 CYP450在田间抗性品系中过表达根据本实验室已经克隆得到的CYP450的核酸序列，我们利用荧光定量PCR技术，对已经得到的68个CYP450基因进行了定量分析（见图1）。结果表明4个CYP450基因（CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1和CYP6AE10）在高效氯氟氰菊脂抗性品系中的表达量与室内敏感品系相比表现出有明显的高表达（无显著变化的没有列出）。其中CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1相对敏感品系有约50倍的表达量的差异，CYP6AE10基因在抗性品系中有大约100倍的高表达。图1 CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1和CYP6AE10在高效氯氟氰菊脂抗性品系中的相对表达量。2.2 CYP450基因上游序列的克隆在本研究中，我们运用SDS-蛋白酶K法提取了甜菜夜蛾敏感品系的基因组，用紫外/可见分光分度计检测到基因组的浓度和纯度，并且使用0.7%的琼脂糖凝胶电泳对基因组的完整度进行鉴定，通过这两种鉴定方法得到的基因组有很好的完整度和较高的丰度。在关于甜菜夜蛾的CYP450基因的上游序列的克隆中，我们以甜菜夜蛾的基因组为模板，其中的上游引物是由试剂盒中提供的AP2，下游引物是采用特异性的引物（SP），进行了巢式PCR，特异性引物的设计原理如图2所示。图2 甜菜夜蛾CYP450基因上游序列的克隆特异性引物设计示意图。CYP321A8和CYP321A16基因在克隆过程中分为3段获得基因序列，得到了上游序列分别为1978和2213bp。CYP6AE10和 CYP332A1基因在克隆过程中分为2段获得基因序列，得到的上游序列的长度分别为1673和2037bp（如表3所示）。表3 甜菜夜蛾CYP450基因上游序列克隆的长度和PCR次数基因获取上游序列(bp)PCR次数CYP321A819783CYP321A1622133CYP6AE1016732CYP332A1203722.3 启动子位点分析表转录位点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应的DNA链上的碱基，研究表明通常为一个嘌呤（A或G）。转录起始位点一般位于TATA盒上游20-30bp的位置，利用启动子位点分析网站Neural Network Promoter Prediction（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html），预测得到了在甜菜夜蛾田间抗性品系中高表达的4个CYP450的5’侧翼序列的转录起预测可能存在的始位点，其转录起始位点上游存在着TATA盒。（见表4）。表4 甜菜夜蛾CYP321A8、CYP321A16、CYP6AE10、CYP332A1 5’侧翼序列可能的转录起始位点CYP450StartEndScorePromoter SequenceCYP321A8-1131-10810.93TTTACAAGTTTATATAGATACCACTGACAAAGAATGAGTGAAATTTGGAC-362-3120.92AAAAAAAGAATATAAACTGTCCGATTTACGAAGAACTAGTACGAATCTCG-40100.98ATATTATATTTATATAAGGTTTGTCAGCTGAAGAAGTAACAAGTGTTTGTCYP321A16-574-5240.82TTTGTCTAGGCACAAAAACCGTCCAAGTGCGAGTCGGCCGAAGGGCTTTC-40100.97AACAGCTGAGTATAAGTACGGCGCGCAATTTACATCTGTATGTTACTTGTCYP6AE10-1061-10510.85CTTTCGTCCTAATAAGAGCGGAAGAAGTCATTGGATGATTTTCACCCCTC-382-3320.83GAAGTTGTATGATTATAACCGCACCCACGACACAGGAGATAGTCCTAGAG-40100.97ATCTAAAGCAGTATAAATACCGAAACAAAGCGGCTACGGCAATCATTCACCYP332A1-150-1000.95ATATTTCTTATATAAATTCGGGACTTGTTTACATTTTTTTATGCCAAGAA-40101GTTGCAAATTTAAAAACTGCCGTCTCACGGTGAGACAGACACGTGTAAAT甜菜夜蛾CYP321A8 5’侧翼序列经预测可能存在3个转录起始位点，CYP321A16 5’侧翼序列可能存在2个转录起始位点，CYP6AE10 5’侧翼序列能存在3个转录起始位点，CYP332A1 5’侧翼序列能存在2个转录起始位点。2.4 转录因子结合位点利用转录因子网站ALGGEN（http://alggen.lsi.upc.edu/）预测得到的结果中（见表5），不仅发现了CYP450基因的5’侧翼序列不仅具有启动子序列必需具有的核心元件TATA框，其中TATA框具有将RNA聚合酶引导到正确转录起始位点的功能，从而使转录精确得开始。同时还具有结合位点Ftz、Zen-1、GAGA factor和Dfd等。其中CYP321A8序列的5’侧翼序列经预测存在22个录因子结合位点，CYP321A16序列的5’侧翼序列经预测得到20个转录因子结合位点，CYP6AE10序列的5’侧翼序列经预测得到22个转录因子结合位点，CYP332A1序列的5’侧翼序列经预测得到25个转录因子结合位点。这些预测得到的的转录因子中，Dfd、Ftz、Prd和Antp等转录因子在这4个CYP450酶的5’侧翼序列中都存在着结合位点，但在得到的结果中每个CYP450 基因中预测得到的转录因子也有不同，如GAGA factor经预测在CYP321A8、CYP6AE10和CYP332A1都存在结合位点，但在CYP321A16不存在该转录因子的结合位点。表5 CYP450上游序列中转录因子结合位点的种类与数量转录因子CYP321A8CYP321A16CYP6AE10CYP332A1Adf-1888Antp13131313B factor?8888Bcd99Dfd8888Dl9999DSXF7777DSXM7777DTF-1111111E2F888E74A1111En11Eve9999Ftz4444GAGA factor888GCM9999Gt11111111Hb7777Kr111111Mad5555Prd7777SGF-311111111Sry-delta13Tll6666Ttk 69K8Zen-19999Zeste7773 讨论昆虫细胞色素P450以多种不同的类型存在于同一生物体内，不同的昆虫的P450基因的数量存在显著的差异，已知基因组的昆虫中P450基因的数量介于36～170种之间。在本文中，我们采用的甜菜夜蛾田间抗性品系在多种杀虫剂表现出了中等到高等的抗性水平。根据本实验已经获得的甜菜夜蛾的CYP450的核酸序列，设计荧光定量引物，利用荧光定量PCR技术检测到的了4个在抗性品系中高表达的CYP450 基因，分别是CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1和CYP6AE10。因此我们推断这4个CYP450 基因可能与甜菜夜蛾对杀虫剂的抗性有关。P450介导的杀虫剂代谢解毒活性增加可以使昆虫对杀虫剂产生抗性。与抗性相关的P450的酶量增加已发现两种机制一是基因组层面上的基因拷贝数的增加，是基因重复或基因扩增的结果；二是基因转录层面上的基因上调表达，受顺式或反式因子、或顺式与反式因子的共同调控[17]。P450调节基因的突变在杀虫剂抗药性中起中心作用。因此在本研究中我们对在甜菜夜蛾中有高表达的4个CYP450 基因的上游的5’侧翼序列进行克隆。在结果我们克隆得到了这4个基因上游1600～2200bp不等的DNA序列，在利用软件或网站对已经获得5’侧翼序列进行预测，其中主要包括对启动子位点和转录因子结合位点的预测。甜菜夜蛾P450的研究目前尚属起步阶段，其抗性相关基因表达调控机制尚未得到验证。本实验是基于分子水平对甜菜夜蛾P450基因进行研究，实验结果为进一步研究甜菜夜蛾P450基因的表达与调控奠定了坚实基础。致 谢感谢实验室师兄胡波博士在日常工作、学习和生活中的大力帮助。实验之初，胡波师兄在其百忙之中一步一步指导我进行实验操作，将其获得的知识倾囊相授。在实验遇到困境时，胡波师兄总能指出问题所在，帮助我将实验顺利进行。在论文写作中，胡波师兄帮助我整理数据，对论文各方面作出指导。谢谢胡波师兄。接下来感谢实验室的魏琪师兄、居晓敏师姐、慕希超师兄、任淼淼师姐、王利祥师兄、赵佩瑶师兄、赵晨师兄、周丽琪师姐、王世玉师姐、汤雨洁师姐、黄河师兄、钮建国师兄、薛圆师姐、李剑师兄、姜娜娜师姐、曾斌师兄等在生活学习中对我的帮助。感谢班主任黄韶华、辅导员李艳丹和张聪，他们对我本科期间的学习生活产生了重要的影响，给我指明了生活就业的方向。感谢各位同学和朋友在日常学习和生活中的支持，尤其是各位舍友的支持与鼓励，谢谢王世杰、黄申、冉启凰、任子奇、谢约翰。感谢我的父母和家人，他们一直都在背后支持鼓励我，是我在学校生活和学习的坚强后盾，同时也是我不断前进的动力。感谢每一个帮助过我的人，谢谢您们！王帅帅2017年4月1日星期六参考文献[1]倪智伟,蒲冠勤.昆虫抗药性机制研究进展[J].江苏蚕业,2006,4:21-23.[2]潘贻武,刘宁,刘小宁.昆虫细胞色素P450的研究进展及其介导的抗药性[J].2007,44(4):470-475.[3]Mansuy D.The great diversity of reactions catalyzed by cytochromes P450[J].Comparative Biochchemistry and Physiology Pan C:Pharmacology, Toxicology and Endocrinology,1998,121:5-14.[4]王燕红. 野桑蚕细胞色素P450基因的克隆、组织表达及其功能研究[D]. 苏州大学. 2009. [5]高瑞娜. 家蚕细胞色素P450的基因表达调控研究[D]. 苏州大学. 2011. [6]冯纪年,田宏刚,郭付振等.昆虫细胞色素P450研究进展[J].昆虫生理生化.2004:200-206.[7]郭亭亭,姜辉昆虫细胞色素P450基因的多样性、进化及表达调控[J].昆虫学报.2009,52(3):301-311.[8]周颖君.棉铃虫细胞色素P450 CYP9A亚家族的表达调控机理及进化关系研究[D].硕士学位论文,南京:大学,2007.[9]丁天波. 柑橘全爪螨细胞色素P450及其相关基因的鉴定和表达模式研究[D].博士学位论文,重庆:西南大学,2016. [10] T D Sutherland，Gopalan C Unnithan．A cytochrome P450 terpenoid hydroxylase linked to the suppression of insect juvenile hormone synthesis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1998,95(22):12884-12889.[11] Jochen Winter，Graeme Bilbe，Hanny Richener,et al.Cloning of a cDNA Encoding a Novel Cytochrome P450 from the Insect Locusta migratoria: CYP6H1, a Putative Ecdysone 20-Hydroxylase[J].Biochemical and Biophysical Research Communications.1999,259(2):305-310. [12] Feyereisen R．Insect P450 enzymes[J].Annual Review of Entomology.1999,44:507-533.[13]Chung H,Bogwitz M R,McCart C,Andrianopoulos A,et a1.Cis-regulatory elements in the Accord retrotransposon result in tissue-specific expression of the Drosophila melanogaster insecticide resistance gene Cyp6g1[J].Genetics,2007,175:1071-1077.[14]Gao J,Scott J G. Role of the transcriptional repressor mdGfi-1 in CYP6D1v1-mediated insecticide resistance in the house fly, Musca domestica[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2006,36:387-395.[15]唐振华.昆虫中的细胞色素P450及其特性[J].昆虫知识,1990,27（1）:52-55.[16]Prapaipong H,Berenbaum M R,Shuler M A. Transcriptional regulation of the Papiliopolyxenes CYP6B1 gene[J].Nucleic Acids Research,1994,22(15):3210-3217.[17]邱星辉,冷欣夫.昆虫细胞色素P450基因的表达与调控及P450介导抗性的分子机制[J].农药学学报,1999,1(1):7-14.
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1RNA提取2
1.2.2RTPCR3
1.2.3定量PCR检测mRNA表达量3
1.2.4DNA提取3
1.2.5基因组步移3
1．3转录因子结合位点预测 5
1.4统计分析 5
2结果与分析5
2.1CYP450在田间抗性品系中过表达5
2.2CYP450基因上游序列的克隆5
2.3启动子位点分析表6
2.4转录因子结合位点6
3讨论 7
致谢9
参考文献10
甜菜夜蛾P450基因上游调控序列分析
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/188.html
