oligos在长穗偃麦草（10×）染色体上的分布特征
寡聚核苷酸（oligos）是一类短核苷酸的总称，合成的寡核苷酸探针可用于进行荧光原位杂交，有复杂度低、杂交迅速、步骤简单、成本低廉等许多优点。基于前人报道的物种专化重复序列，已经成功开发出一批寡聚核苷酸探针，目前在小麦、大麦和黑麦上均得到了成功运用。本研究利用3类共51个寡聚核苷酸探针对小麦的近缘物种长穗偃麦草（10×）进行ND-FISH分析，旨在了解oligos在长穗偃麦草（10×）染色体上的分布特征。结果显示，7个探针在长穗偃麦草（10×）出现清晰稳定的杂交信号，3个探针信号丰富，可以用于核型分析，8个探针信号不稳定，其余33个探针没有明显的杂交信号。本研究初步揭示了部分oligos在长穗偃麦草染色体（10×）的分布情况，为进一步开发长穗偃麦草（10×）细胞学标记并构建清晰的核型提供了有用信息。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1根尖细胞有丝分裂中期染色体制片4
1.2.2非变性荧光原位杂交4
2结果与分析6
2.1 SSRoligos分析 6
2.2基于pSc 119.2和pAs1的oligos分析6
2.3其他oligos分析8
3讨论8
致谢9
参考文献9
Oligos在长穗偃麦草（10×）染色体上的分布特征
引言
引言
寡核苷酸（oligos）是一类短核苷酸的总称，较易与其互补DNA链配对，作为探针可以确定DNA或RNA的结构［1］。合成的寡核苷酸探针可用于进行荧光原位杂交，由于单链oligos探针不需要变性，因此染色体也可以不用变性而直接进行非变性荧光原位杂交(nondenaturing FISH，简称NDFISH），使实验更加简便快捷。该技术最早由Cuadrado et al.（2009）根据端粒的特殊结构发展而来，其最大优点是不需对染色体进行变性便可直接进行FISH［2］。Cuadrado et al.（2010）后来进一步发展了此技术，发现短的
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单链重复序列如(GAA)5经荧光素标记后，也可进行NDFISH，并且产生的信号同普通FISH一样清晰。这种NDFISH与普通的FISH相比，不管是在探针标记方面，还是整个原位杂交实验流程方面，都有了很大的改善，所需的实验时间更短，大大提高了实验效率［3］。基于SSRoligos的NDFISH一般使用带有荧光标记的简单序列重复(SSRs)作为探针，杂交中不需要进行探针和染色体的变性使得检测简单快捷。SSRs探针可检测出染色体SSR富集区域，不但可以利于识别染色体,同时为染色体多态性研究提供了信息［3］。
Oligos探针的开发和应用为植物染色体工程提供了新的强有力的工具。Oligos的开发最早在人类中进行了报道［4~5］，随后随着基因组测序的发展，高效开发染色体特异oligos的方法得到更大的发展和应用［6~7］。目前在人类、果蝇［7］、小麦、大麦、黑麦［8~11］和黄瓜［12］等也得到了成功运用，其中，oligo SSRFISH不仅可比较SSR在不同物种染色体上的分布，对植物育种实践和研究染色体的结构、功能及其进化也将起重要作用［910］。
pSc119.2和pAs1是分别来自黑麦和节节麦的物种专化重复序列［13~15］，广泛用于多个物种的染色体分析。王艳芝（2013）最早将这两个重复序列克隆开发成oligos成功代替原质粒克隆用于染色体分析，大大简化了小麦FISH程序，为小麦染色体工程提供更有效的工具［1］。Tang et al.(2014)进一步开发了更多重复序列的oligos用于小麦染色体鉴定［11］。本研究利用已经开发的寡核苷酸探针对长穗偃麦草（10×）染色体进行NDFISH分析，旨在了解oligos在长穗偃麦草（10×）染色体上的分布特征，为构建高清晰核型鉴定有用的细胞学标记，为更好地转移和利用这些物种的有利基因提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
实验选取小麦的近缘物种长穗偃麦草（10×）(Thinopyrum ponticum,2n=10×=70)为供试材料。
1．2 方法
1.2.1根尖细胞有丝分裂中期染色体制片
将种子放置于有湿滤纸的培养皿中，24 ℃恒温箱中培养至根长1.02.0 cm时，取根尖置于0℃冰水混合物中预处理48 h，转入卡诺氏固定液（无水乙醇：冰醋酸体积比为3:1）中处理24 h，一周后用45%乙酸解离制片，然后置于70 ℃冰箱冻存3 h以上，揭去盖玻片后放入无水乙醇中脱水30 min以上，取出气干备用。
1.2.2 非变性荧光原位杂交
本课题用于FISH的寡聚核苷酸探针包括三类：第一类为34个SSRoligos，分别为 (AT)15、(AGG)10、(GAA)10、(GAA)19、(AC)29、(AG)8、(AGG)10、(AGG)19、(AT)29、(CAG)10、(CAG)19、(CAT)10、(CAT)19、(GA)29、(GAA)5、(GC)29、(GCC)10、(GCC)19、(TTTAGGG)5、(ATT)10、(A)35、(CAC)10、(ACG)10、(ATT)19、(CAC)19、(ACG)19、(CAC)5、(ACT)5、(AGG)5、(CAT)5、(AC)15、(GA)15、(GC)15、(AAC)19，这些不同长度的oligos根据Cudrado et al.(2010; 2008a; 2008b)报道的基础上直接合成或进行了长度调整，以筛选更稳定的SSRoligos；第二类为基于pSc119.2和pAs1开发的9个oligos，均为本实验室开发；第三类为根据其他序列开发的8个oligos，其中3个为Tang et al. (2014)报道的oligos (OligoCCS1、OligopTa5351和OligopTa712) ［10］，其余由本实验室开发；后两类oligos序列信息见表1。
表1 不同oligos探针的序列信息
Table1 Sequences of different oligos probes
探针名称 Oligos
序列 Sequences
pSc119.21A1
GGC CAG AAT CGG CCA
pSc119.21A2
AAA CTA CGA GTG CTG
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1根尖细胞有丝分裂中期染色体制片4
1.2.2非变性荧光原位杂交4
2结果与分析6
2.1 SSRoligos分析 6
2.2基于pSc 119.2和pAs1的oligos分析6
2.3其他oligos分析8
3讨论8
致谢9
参考文献9
Oligos在长穗偃麦草（10×）染色体上的分布特征
引言
引言
寡核苷酸（oligos）是一类短核苷酸的总称，较易与其互补DNA链配对，作为探针可以确定DNA或RNA的结构［1］。合成的寡核苷酸探针可用于进行荧光原位杂交，由于单链oligos探针不需要变性，因此染色体也可以不用变性而直接进行非变性荧光原位杂交(nondenaturing FISH，简称NDFISH），使实验更加简便快捷。该技术最早由Cuadrado et al.（2009）根据端粒的特殊结构发展而来，其最大优点是不需对染色体进行变性便可直接进行FISH［2］。Cuadrado et al.（2010）后来进一步发展了此技术，发现短的
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单链重复序列如(GAA)5经荧光素标记后，也可进行NDFISH，并且产生的信号同普通FISH一样清晰。这种NDFISH与普通的FISH相比，不管是在探针标记方面，还是整个原位杂交实验流程方面，都有了很大的改善，所需的实验时间更短，大大提高了实验效率［3］。基于SSRoligos的NDFISH一般使用带有荧光标记的简单序列重复(SSRs)作为探针，杂交中不需要进行探针和染色体的变性使得检测简单快捷。SSRs探针可检测出染色体SSR富集区域，不但可以利于识别染色体,同时为染色体多态性研究提供了信息［3］。
Oligos探针的开发和应用为植物染色体工程提供了新的强有力的工具。Oligos的开发最早在人类中进行了报道［4~5］，随后随着基因组测序的发展，高效开发染色体特异oligos的方法得到更大的发展和应用［6~7］。目前在人类、果蝇［7］、小麦、大麦、黑麦［8~11］和黄瓜［12］等也得到了成功运用，其中，oligo SSRFISH不仅可比较SSR在不同物种染色体上的分布，对植物育种实践和研究染色体的结构、功能及其进化也将起重要作用［910］。
pSc119.2和pAs1是分别来自黑麦和节节麦的物种专化重复序列［13~15］，广泛用于多个物种的染色体分析。王艳芝（2013）最早将这两个重复序列克隆开发成oligos成功代替原质粒克隆用于染色体分析，大大简化了小麦FISH程序，为小麦染色体工程提供更有效的工具［1］。Tang et al.(2014)进一步开发了更多重复序列的oligos用于小麦染色体鉴定［11］。本研究利用已经开发的寡核苷酸探针对长穗偃麦草（10×）染色体进行NDFISH分析，旨在了解oligos在长穗偃麦草（10×）染色体上的分布特征，为构建高清晰核型鉴定有用的细胞学标记，为更好地转移和利用这些物种的有利基因提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
实验选取小麦的近缘物种长穗偃麦草（10×）(Thinopyrum ponticum,2n=10×=70)为供试材料。
1．2 方法
1.2.1根尖细胞有丝分裂中期染色体制片
将种子放置于有湿滤纸的培养皿中，24 ℃恒温箱中培养至根长1.02.0 cm时，取根尖置于0℃冰水混合物中预处理48 h，转入卡诺氏固定液（无水乙醇：冰醋酸体积比为3:1）中处理24 h，一周后用45%乙酸解离制片，然后置于70 ℃冰箱冻存3 h以上，揭去盖玻片后放入无水乙醇中脱水30 min以上，取出气干备用。
1.2.2 非变性荧光原位杂交
本课题用于FISH的寡聚核苷酸探针包括三类：第一类为34个SSRoligos，分别为 (AT)15、(AGG)10、(GAA)10、(GAA)19、(AC)29、(AG)8、(AGG)10、(AGG)19、(AT)29、(CAG)10、(CAG)19、(CAT)10、(CAT)19、(GA)29、(GAA)5、(GC)29、(GCC)10、(GCC)19、(TTTAGGG)5、(ATT)10、(A)35、(CAC)10、(ACG)10、(ATT)19、(CAC)19、(ACG)19、(CAC)5、(ACT)5、(AGG)5、(CAT)5、(AC)15、(GA)15、(GC)15、(AAC)19，这些不同长度的oligos根据Cudrado et al.(2010; 2008a; 2008b)报道的基础上直接合成或进行了长度调整，以筛选更稳定的SSRoligos；第二类为基于pSc119.2和pAs1开发的9个oligos，均为本实验室开发；第三类为根据其他序列开发的8个oligos，其中3个为Tang et al. (2014)报道的oligos (OligoCCS1、OligopTa5351和OligopTa712) ［10］，其余由本实验室开发；后两类oligos序列信息见表1。
表1 不同oligos探针的序列信息
Table1 Sequences of different oligos probes
探针名称 Oligos
序列 Sequences
pSc119.21A1
GGC CAG AAT CGG CCA
pSc119.21A2
AAA CTA CGA GTG CTG
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