大豆疫霉效应分子pscrn108功能研究相关载体构建
大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产中的毁灭性病害之一，每年在全球范围内造成10-20亿美元的经济损失。大豆疫霉菌能分泌大量的效应因子来促进其侵染与定殖，CRN基因就是其中一组具有引起或抑制植物细胞死亡活性的效应分子。通过研究证明，CRN效应分子进入细胞核可能具有某些功能，来促进病原菌的侵染。然而，目前对CRN效应因子的毒性作用机制还知之甚少。本研究构建PsCRN108连T载体、pTORM-PsCRN108-RFP载体和pBIN-PsCRN108-NLSm载体，为研究效应分子PsCRN108在侵染植物过程中的定位以及在植物细胞中的核定位对抑制植物防卫反应的影响提供基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Keywords 1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验菌株的保存与培养 2
1.2 培养基制备 2
1.3 酶和实验试剂 2
1.4 主要仪器 2
1.5 载体构建 3
1.5.1 大豆疫霉基因组DNA的提取3
1.5.2 DNA的PCR扩增3
1.5.3 DNA的回收3
1.5.4 酶切和T4 DNA ligase连接4
1.5.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备4
1.5.6 热激转化大肠杆菌4
1.5.7 菌落PCR鉴定5
1.5.8 质粒提取5
1.6 PsCRN108相关载体构建 5
1.6.1 PsCRN108连T载体5
1.6.2 pTORMPsCRN108RFP载体构建6
1.6.3 pBINPsCRN108NLSm载体构建8
2 结果与分析9
2.1 PsCRN108连T载体的结果与分析 9
2.2 pTORMPsCRN108RFP载体构建的结果与分析 10
2.3 pBINPsCRN108NLSm载体构建的结果与分析 12
3 讨论13 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
致谢13
参考文献14
大豆疫霉效应分子PsCRN108功能研究相关载体构建
引言
大豆疫霉（P. sojae）隶属茸鞭生物界鞭毛菌亚门卵菌纲疫霉属，是一类形态上与真菌相似，进化上却和藻类相近的真核微生物，其侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产中的一种毁灭性病害[1]，在世界范围内每年可造成数十亿美元的经济损失[2]。就疫霉菌而言，目前鉴定到的100多个种均是植物病原菌[3]，面对如此庞大的病原家族，我们对疫霉菌致病机制的认识仍十分有限，因此在农业生产上也缺乏行之有效的疫霉病害防控策略[1]。
近年来，包括致病疫霉菌(Phytophthora infestans)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、寄生疫霉菌（Phytophthora parasitica）等几个重要病原疫霉菌基因组测序的完成使得人们对疫霉菌的致病机理有了更进一步的认识[4]。
病原菌为了侵染植物，必须成功攻克植物的防卫反应[5]。同其他病原菌相似，疫霉菌会分泌一类小分子蛋白参与和调控植物的生理过程从而利于病菌的定殖[68]，这类分泌的毒性蛋白被称为效应分子[910]。卵菌病原物分泌的效应分子CRN，是一种入侵寄主细胞质的效应分子[11]。起初，这些效应分子是由于其侵染植物细胞、引起植物细胞的死亡和防卫反应而被发现的[12]。随着深入研究的进行，他们发现CRN家族基因是个非常庞大的基因家族，基因数目非常多，其中大豆疫霉有202个[6]（100个基因和102个假基因）。CRN家族在N端的大约50个氨基酸左右的位置含有FLAK序列元件，这个序列元件就是CRN家族进入寄主细胞所必须的[13]。CRN家族的C端是它的功能区域,根据其序列的保守性，Haas等[14]将致病疫霉的CRN家族的C端归纳出36个保守的功能域，并且发现CRN基因具有干扰寄主细胞生理的功能，具有引起细胞死亡的活性。
本次研究主要目标是PsCRN108连T载体、PtormPsCRN108RFP载体和pBINPsCRN108NLSm载体的构建。通过设计引物，从大豆疫霉基因组中克隆出PsCRN108基因并构建出符合要求的载体。此外，由于疫霉菌变异复杂、繁殖速度快、传播迅速、生存能力强、缺少有效的杀菌剂、病菌容易产生抗药性。因此了解大豆疫霉致病过程的分子遗传学基础，揭示致病的效应蛋白的生物学特性可以为寻找新的杀菌剂作用靶标，设计新的疫病控制策略提供理论指导。构建这三种载体是研究该基因功能的重要部分，是从分子水平上揭示大豆疫霉病害发生机制和开发控制病害措施的基础。
1 材料与方法
1．1 实验菌株的保存与培养
1）大豆疫霉全基因组测序菌株P6497由美国Virginia生物信息研究所的Brett M.Tyler教授馈赠，在大学植物保护学院植病系植物与疫霉互作实验室保存。菌株保存采用10% V8固体培养基试管斜面，10℃保存。为提取该菌株基因组DNA ，从新鲜的菌落边缘切取1:1菌丝块，置于20ml 10% V8培养液中，于25℃黑暗静置培养2d。
2）大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株DH5α由大学植病系植物与疫霉互作实验室保存。以甘油菌的形式保存在70℃冰箱。用于构建、扩增和保存载体。
1. 2 培养基制备
（1） LB培养基（1L）
胰蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
NaCl 10g 固体再加入 1.5% 琼脂粉。
（2）10% V8液体培养基：100 mL V8 汁加入 1 g CaCO3 后，3000 rpm/min离心 5 min，取上清液与去离子水 1：9比例稀释。
10% V8固体培养基：在 10%的 V8培养液中加入 1.0%的琼脂粉。
上述培养基均在 121℃高压灭菌 20 min。
1. 3 酶和实验试剂
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Keywords 1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验菌株的保存与培养 2
1.2 培养基制备 2
1.3 酶和实验试剂 2
1.4 主要仪器 2
1.5 载体构建 3
1.5.1 大豆疫霉基因组DNA的提取3
1.5.2 DNA的PCR扩增3
1.5.3 DNA的回收3
1.5.4 酶切和T4 DNA ligase连接4
1.5.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备4
1.5.6 热激转化大肠杆菌4
1.5.7 菌落PCR鉴定5
1.5.8 质粒提取5
1.6 PsCRN108相关载体构建 5
1.6.1 PsCRN108连T载体5
1.6.2 pTORMPsCRN108RFP载体构建6
1.6.3 pBINPsCRN108NLSm载体构建8
2 结果与分析9
2.1 PsCRN108连T载体的结果与分析 9
2.2 pTORMPsCRN108RFP载体构建的结果与分析 10
2.3 pBINPsCRN108NLSm载体构建的结果与分析 12
3 讨论13 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
致谢13
参考文献14
大豆疫霉效应分子PsCRN108功能研究相关载体构建
引言
大豆疫霉（P. sojae）隶属茸鞭生物界鞭毛菌亚门卵菌纲疫霉属，是一类形态上与真菌相似，进化上却和藻类相近的真核微生物，其侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产中的一种毁灭性病害[1]，在世界范围内每年可造成数十亿美元的经济损失[2]。就疫霉菌而言，目前鉴定到的100多个种均是植物病原菌[3]，面对如此庞大的病原家族，我们对疫霉菌致病机制的认识仍十分有限，因此在农业生产上也缺乏行之有效的疫霉病害防控策略[1]。
近年来，包括致病疫霉菌(Phytophthora infestans)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、寄生疫霉菌（Phytophthora parasitica）等几个重要病原疫霉菌基因组测序的完成使得人们对疫霉菌的致病机理有了更进一步的认识[4]。
病原菌为了侵染植物，必须成功攻克植物的防卫反应[5]。同其他病原菌相似，疫霉菌会分泌一类小分子蛋白参与和调控植物的生理过程从而利于病菌的定殖[68]，这类分泌的毒性蛋白被称为效应分子[910]。卵菌病原物分泌的效应分子CRN，是一种入侵寄主细胞质的效应分子[11]。起初，这些效应分子是由于其侵染植物细胞、引起植物细胞的死亡和防卫反应而被发现的[12]。随着深入研究的进行，他们发现CRN家族基因是个非常庞大的基因家族，基因数目非常多，其中大豆疫霉有202个[6]（100个基因和102个假基因）。CRN家族在N端的大约50个氨基酸左右的位置含有FLAK序列元件，这个序列元件就是CRN家族进入寄主细胞所必须的[13]。CRN家族的C端是它的功能区域,根据其序列的保守性，Haas等[14]将致病疫霉的CRN家族的C端归纳出36个保守的功能域，并且发现CRN基因具有干扰寄主细胞生理的功能，具有引起细胞死亡的活性。
本次研究主要目标是PsCRN108连T载体、PtormPsCRN108RFP载体和pBINPsCRN108NLSm载体的构建。通过设计引物，从大豆疫霉基因组中克隆出PsCRN108基因并构建出符合要求的载体。此外，由于疫霉菌变异复杂、繁殖速度快、传播迅速、生存能力强、缺少有效的杀菌剂、病菌容易产生抗药性。因此了解大豆疫霉致病过程的分子遗传学基础，揭示致病的效应蛋白的生物学特性可以为寻找新的杀菌剂作用靶标，设计新的疫病控制策略提供理论指导。构建这三种载体是研究该基因功能的重要部分，是从分子水平上揭示大豆疫霉病害发生机制和开发控制病害措施的基础。
1 材料与方法
1．1 实验菌株的保存与培养
1）大豆疫霉全基因组测序菌株P6497由美国Virginia生物信息研究所的Brett M.Tyler教授馈赠，在大学植物保护学院植病系植物与疫霉互作实验室保存。菌株保存采用10% V8固体培养基试管斜面，10℃保存。为提取该菌株基因组DNA ，从新鲜的菌落边缘切取1:1菌丝块，置于20ml 10% V8培养液中，于25℃黑暗静置培养2d。
2）大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株DH5α由大学植病系植物与疫霉互作实验室保存。以甘油菌的形式保存在70℃冰箱。用于构建、扩增和保存载体。
1. 2 培养基制备
（1） LB培养基（1L）
胰蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
NaCl 10g 固体再加入 1.5% 琼脂粉。
（2）10% V8液体培养基：100 mL V8 汁加入 1 g CaCO3 后，3000 rpm/min离心 5 min，取上清液与去离子水 1：9比例稀释。
10% V8固体培养基：在 10%的 V8培养液中加入 1.0%的琼脂粉。
上述培养基均在 121℃高压灭菌 20 min。
1. 3 酶和实验试剂
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