水稻淀粉合成相关突变体的鉴定与基因定位
水稻是重要的粮食作物，其胚乳中的淀粉含量和组成直接影响水稻的产量与品质。因此，深入研究水稻这一单子叶模式植物淀粉合成途径中的关键因子及调控网络具有重要的理论意义与应用价值。目前，水稻中已经发现了一系列的淀粉粉质突变体，对这些粉质突变体的研究，有利于我们进一步了解水稻淀粉合成的分子机制，从而提高水稻的产量和品质。本研究以通过MNU诱变获得的宁粳4号籽粒粉质突变体F1213为研究材料，对其表型进行鉴定，并构建作图群体对目标基因进行精细定位。结果表明，突变体胚乳不透明，种子表面皱缩，横截面呈粉质。F1213基因定位在第三条染色体短臂I3-11与N3-16标记之间513 kb的区域内。本研究为后期基因的克隆及阐述基因的功能奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1材料来源 2
1.1.2定位群体 2
1.2实验方法 3
1.2.1种子发苗3
1.2.2水稻基因组DNA的制备（CTAB法）3
1.2.2.1 CTAB溶液的配制 3
1.2.2.2 提取DNA 3
1.2.2.3 DNA浓度及质量检测 4
1.2.3 PCR反应4
1.2.4 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)4
1.2.5 F1213基因的初定位 5
1.2.6 F1213基因的精细定位 6
2 结果与分析7
2.1 突变体种子的外观表型 7
2.2突变体种子的千粒重7
2.3 F1213突变体种子储藏蛋白质分析8
2.4 F1213基因的粗定位 8
2.5 F1213基因的精细定位 9
3讨论9
3.1 淀粉粉质突变体在育种中的应用前景 9
3.2 F1213是一个新的谷蛋白前体增加突变体 10
3.3 本研究的创新和不足10
致谢 10
参考文献11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
水稻淀粉合成相关突变体的鉴定与基因定位
引言
水稻籽粒的干物质主要有淀粉和少量的蛋白质和脂肪。水稻淀粉占种子干重的6080%，是植物碳源的主要储存形式，是决定稻米产量和品质的重要因素，是稻米食用的最主要部分。在种子形成过程中，贮藏淀粉是在造粉体内经过一系列淀粉合成酶催化加工形成可见的淀粉颗粒的过程，伴随着胚乳细胞内的造粉体和淀粉粒的增殖和发育，种子逐渐膨大成熟，最后随着膜结构降解，整个胚乳内充满了排列整齐的淀粉颗粒，这是个复杂精细的生物学过程。人们目前对这个生物学过程了解的并不清楚，因此研究水稻淀粉的生物合成相关基因具有重要的生物学意义和广阔的应用前景。
淀粉是一种结构复杂，成分简单的物质。从化学成分上来说，淀粉由支链淀粉和直链淀粉构成。支链淀粉占总淀粉比重的7580%，并且能够形成结晶，导致不溶的淀粉颗粒的形成。这种高密度稳定的淀粉颗粒，是植物长期进化的结果，有利于可溶性光合产物的固定[1]。直链淀粉由α1,4糖苷键连接而成（一般有大约10005000个葡萄糖单体），几乎没有分支。支链淀粉有高度分支，大约每2025个α1,4糖苷键就有一个α1,6糖苷键分支，每个独立的分支可由6100个葡萄糖单体组成。另外在淀粉颗粒中除了葡聚糖外，还有微量的蛋白质、脂肪和无机离子。
目前，水稻中已经发现一系列粉质突变体，包括糯性(waxy, WX)、糖质(sugary, su)、粉质(floury, flo)、皱缩(shrunken, sh)、暗色(dull, du)、心白(whitecore, wc)等类型[2]。目前已报道的水稻粉质突变体有flo1、flo2、flo3、flo4、flo5、flo6、flo7[3]。其中，淀粉含量较高的突变体是flo1，粒型与野生型相当，flo1的突变基因定位于第5染色体[4]。Flo2是个特异性植物表达基因，位于第4染色体上[5]。Flo3也是位于第3条染色体，其16kDa球蛋白的含量明显降低[6]。flo4和flo5均是由TDNA插入突变体，Flo4是OsPPKDB基因编码的磷酸丙酮酸双激酶(Pyruvate orthophosphate Dikinase, PPDK)，OsPPKDB 在第5染色体，在受精后的生殖器官中表达，主要是发育中的胚乳、糊粉层、盾片，开花后 10 天前表达量最高[7]。FLO5位于第 8 染色体，编码 OsSSIIIa，在开花后 515 天表达量最大[8]。flo6突变体是由组织培养获得的突变体，突变基因位于第3条染色体[9]。flo7是从粳稻品种日本晴组培后代中获得的一个粉质突变体，其胚乳表现为白色不透明粉质状，同时突变体种子长度有所增加。突变体flo7成熟种子的直链淀粉含量和胶稠度显著下降。Dull1基因是通过图位克隆的手段得到的，该基因位于第 10 染色体，编码一个mRNA前体加工蛋白，主要在胚乳中表达。du1突变体的种子外观接近糯米，直链淀粉含量比糯米高，明显低于野生型。在du1突变体中Wxb基因的premRNA剪切效率下降 30%，而编码其他与淀粉合成有关酶的基因的剪切效率没有变化，说明 Du1对Wxb的剪切过程产生影响[10] 。dull3(du3)突变体的直链淀粉含量为7%，比du1 高，明显低于野生型。du3 中 Wxb基因premRNA 的剪切效率降低。通过图位克隆的方法将 du3 定位于第 2 染色体的长臂上，编码一个近似于人类CBP20(CapBinding Protein 20kD subunit)的蛋白，定位到细胞核中，是帽结合复合物 (CapBinding Complex, CBC)的一个组成部分，参与到premRNA剪切和外运过程中[11]。当前，许多参与水稻淀粉合成相关基因已经被克隆出来并进行相关功能的研究，以及淀粉合成代谢相关网络也已初步建立，但是相关基因间的互作和对相关酶的调控途径了解并不多，故仍有很多相关研究工作需要进行。
本研究以通过MNU诱变获得宁粳4号籽粒粉质突变体为研究材料，通过与籼稻品种N22杂交配组，获得F2群体并进行表型鉴定挑选粉质种子发苗，提取DNA进行初定位和精细定位。本研究为后期基因克隆及全面阐述基因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 材料来源
F1213突变体的野生型宁粳4号是南农大水稻研究所万建民教授主持选育的中熟中粳品种，利用,1mM N甲基N亚硝基脲(MNU)诱变剂对宁粳4号的受精卵进行诱变从而获得了F1213水稻粉质突变体。
1．1．2 定位群体
将F1213与N22配组，杂交种F1自交获得F2群体，选用粉质表型分离明显的F2代个体提取DNA进行基因定位。
1．2 实验方法
1.2.1 种子发苗
(1)选取粉质种子，手剥种子去壳成糙米，(以下操作在超净台内完成)选取胚完整的种子放入灭菌的10 mL 管中，加 5 mL 70%的酒精，手摇振荡2 min,倒掉酒精，用去离子水漂洗3次。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1材料来源 2
1.1.2定位群体 2
1.2实验方法 3
1.2.1种子发苗3
1.2.2水稻基因组DNA的制备（CTAB法）3
1.2.2.1 CTAB溶液的配制 3
1.2.2.2 提取DNA 3
1.2.2.3 DNA浓度及质量检测 4
1.2.3 PCR反应4
1.2.4 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)4
1.2.5 F1213基因的初定位 5
1.2.6 F1213基因的精细定位 6
2 结果与分析7
2.1 突变体种子的外观表型 7
2.2突变体种子的千粒重7
2.3 F1213突变体种子储藏蛋白质分析8
2.4 F1213基因的粗定位 8
2.5 F1213基因的精细定位 9
3讨论9
3.1 淀粉粉质突变体在育种中的应用前景 9
3.2 F1213是一个新的谷蛋白前体增加突变体 10
3.3 本研究的创新和不足10
致谢 10
参考文献11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
水稻淀粉合成相关突变体的鉴定与基因定位
引言
水稻籽粒的干物质主要有淀粉和少量的蛋白质和脂肪。水稻淀粉占种子干重的6080%，是植物碳源的主要储存形式，是决定稻米产量和品质的重要因素，是稻米食用的最主要部分。在种子形成过程中，贮藏淀粉是在造粉体内经过一系列淀粉合成酶催化加工形成可见的淀粉颗粒的过程，伴随着胚乳细胞内的造粉体和淀粉粒的增殖和发育，种子逐渐膨大成熟，最后随着膜结构降解，整个胚乳内充满了排列整齐的淀粉颗粒，这是个复杂精细的生物学过程。人们目前对这个生物学过程了解的并不清楚，因此研究水稻淀粉的生物合成相关基因具有重要的生物学意义和广阔的应用前景。
淀粉是一种结构复杂，成分简单的物质。从化学成分上来说，淀粉由支链淀粉和直链淀粉构成。支链淀粉占总淀粉比重的7580%，并且能够形成结晶，导致不溶的淀粉颗粒的形成。这种高密度稳定的淀粉颗粒，是植物长期进化的结果，有利于可溶性光合产物的固定[1]。直链淀粉由α1,4糖苷键连接而成（一般有大约10005000个葡萄糖单体），几乎没有分支。支链淀粉有高度分支，大约每2025个α1,4糖苷键就有一个α1,6糖苷键分支，每个独立的分支可由6100个葡萄糖单体组成。另外在淀粉颗粒中除了葡聚糖外，还有微量的蛋白质、脂肪和无机离子。
目前，水稻中已经发现一系列粉质突变体，包括糯性(waxy, WX)、糖质(sugary, su)、粉质(floury, flo)、皱缩(shrunken, sh)、暗色(dull, du)、心白(whitecore, wc)等类型[2]。目前已报道的水稻粉质突变体有flo1、flo2、flo3、flo4、flo5、flo6、flo7[3]。其中，淀粉含量较高的突变体是flo1，粒型与野生型相当，flo1的突变基因定位于第5染色体[4]。Flo2是个特异性植物表达基因，位于第4染色体上[5]。Flo3也是位于第3条染色体，其16kDa球蛋白的含量明显降低[6]。flo4和flo5均是由TDNA插入突变体，Flo4是OsPPKDB基因编码的磷酸丙酮酸双激酶(Pyruvate orthophosphate Dikinase, PPDK)，OsPPKDB 在第5染色体，在受精后的生殖器官中表达，主要是发育中的胚乳、糊粉层、盾片，开花后 10 天前表达量最高[7]。FLO5位于第 8 染色体，编码 OsSSIIIa，在开花后 515 天表达量最大[8]。flo6突变体是由组织培养获得的突变体，突变基因位于第3条染色体[9]。flo7是从粳稻品种日本晴组培后代中获得的一个粉质突变体，其胚乳表现为白色不透明粉质状，同时突变体种子长度有所增加。突变体flo7成熟种子的直链淀粉含量和胶稠度显著下降。Dull1基因是通过图位克隆的手段得到的，该基因位于第 10 染色体，编码一个mRNA前体加工蛋白，主要在胚乳中表达。du1突变体的种子外观接近糯米，直链淀粉含量比糯米高，明显低于野生型。在du1突变体中Wxb基因的premRNA剪切效率下降 30%，而编码其他与淀粉合成有关酶的基因的剪切效率没有变化，说明 Du1对Wxb的剪切过程产生影响[10] 。dull3(du3)突变体的直链淀粉含量为7%，比du1 高，明显低于野生型。du3 中 Wxb基因premRNA 的剪切效率降低。通过图位克隆的方法将 du3 定位于第 2 染色体的长臂上，编码一个近似于人类CBP20(CapBinding Protein 20kD subunit)的蛋白，定位到细胞核中，是帽结合复合物 (CapBinding Complex, CBC)的一个组成部分，参与到premRNA剪切和外运过程中[11]。当前，许多参与水稻淀粉合成相关基因已经被克隆出来并进行相关功能的研究，以及淀粉合成代谢相关网络也已初步建立，但是相关基因间的互作和对相关酶的调控途径了解并不多，故仍有很多相关研究工作需要进行。
本研究以通过MNU诱变获得宁粳4号籽粒粉质突变体为研究材料，通过与籼稻品种N22杂交配组，获得F2群体并进行表型鉴定挑选粉质种子发苗，提取DNA进行初定位和精细定位。本研究为后期基因克隆及全面阐述基因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 材料来源
F1213突变体的野生型宁粳4号是南农大水稻研究所万建民教授主持选育的中熟中粳品种，利用,1mM N甲基N亚硝基脲(MNU)诱变剂对宁粳4号的受精卵进行诱变从而获得了F1213水稻粉质突变体。
1．1．2 定位群体
将F1213与N22配组，杂交种F1自交获得F2群体，选用粉质表型分离明显的F2代个体提取DNA进行基因定位。
1．2 实验方法
1.2.1 种子发苗
(1)选取粉质种子，手剥种子去壳成糙米，(以下操作在超净台内完成)选取胚完整的种子放入灭菌的10 mL 管中，加 5 mL 70%的酒精，手摇振荡2 min,倒掉酒精，用去离子水漂洗3次。
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