hplcms法同步测定当归根的香豆素二级医药(附件)
摘 要通过高效液相色谱-质谱法同步测定当归中的9种香豆素，分别为：紫花前胡苷，前胡精，紫花前胡醇，前胡醇，7-羟基香豆素，脱甲基软木花香素，前胡素，紫花前胡醇当归酯，异前胡醚。采用甲醇提取法从当归中获得提取物，借助具有一定浓度梯度的乙腈-水溶剂对提取物进行洗脱分离，并在HPLC上分析提取物的组成。在330nm的检测波长下，能够清晰获得其中六种香豆素的检测峰（2,5,9除外），且在0.2–250 μg/ml浓度范围内浓度与色谱峰面积线性度良好(R2=0.998-0.999)，平均回收率(n=3)在96.5%与110.8%之间。另外三种香豆素化合物的HPLC色谱峰出现了重叠，可以通过HPLC-ESI/MS法在选择性离子探测/选择性离子反应检测模式下进行鉴定。 目 录
1绪论
2实验
2.1仪器与设备 4
2.2试剂与药品 4
2.3标准溶液和样品的制备 4
3结果与讨论
3.1 HPLCDAD工作条件的确定 5
3.2 HPLCDAD检测方法的建立 6
3.2.1线性范围考察 6
3.2.2特征峰解析 6
3.2.3精密度与准确度 7
3.2.4灵敏度 7
3.3商品当归的HPLCDAD分析 7
3.4商品当归的HPLCESI/MS分析 9
4结论
参考文献 13
致谢 15
1绪论
伞形科当归属植物是传统的草药，广泛用于治疗痛经月经不调，更年期综合症、贫血、腹痛、偏头痛和关节炎[1]，还可用于安胎助产，其主要成分是前胡素和前胡醇两种香豆素。前胡素和前胡醇这两种香豆素能够显著提高培养基中大鼠皮质细胞对谷氨酸酯诱导产生的神经毒性的抵抗能力[24]，与紫花前胡苷配合使用还能改善体内东莨菪碱诱发的健忘症[56]。前胡素还具有对人类前列腺癌细胞、人类K562红白血病和U937髓白血病细胞的抗癌活性[710]。
当归作为一种重要的传统草药，也是一种对妇女具有卫生保健功能的食材，在亚洲和欧洲备受关注[1112]。虽然中、日、韩三个国家的药典中均有当归收载，但其基源各不相同，《中国药典》记载的当归为伞形科
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产生的神经毒性的抵抗能力[24]，与紫花前胡苷配合使用还能改善体内东莨菪碱诱发的健忘症[56]。前胡素还具有对人类前列腺癌细胞、人类K562红白血病和U937髓白血病细胞的抗癌活性[710]。
当归作为一种重要的传统草药，也是一种对妇女具有卫生保健功能的食材，在亚洲和欧洲备受关注[1112]。虽然中、日、韩三个国家的药典中均有当归收载，但其基源各不相同，《中国药典》记载的当归为伞形科植物当归Angelica sinesis(Oliv.) Diels的干燥根，《日本药方局》记载的为伞形科当归属东当归Angelicae Acutiloba(Sieb. et Zucc.) Kitagawa的干燥根，《韩国药典》记载的为伞形科当归属朝鲜当归Angelica gigas Nakai的干燥根[12.13]。韩国当归的花色为深紫色，中国和日本当归的花色为白色。文献报道[13]中日两国当归中所含主要成分和功能较相似，为苯酚类物质，具有补血活血、解痉止痛作用，而韩国当归以紫花前胡醇当归酯、紫花前胡醇、紫花前胡苷为主要成分，因此香豆素类化合物可以用作区分韩国当归和中、日当归的标识物。
当归根中的香豆素共有9种，分别为紫花前胡苷，前胡精，紫花前胡醇，前胡醇，7羟基香豆素，脱甲基软木花香素，前胡素，紫花前胡醇当归酯，异前胡醚，其结构如图1.1所示。通过对三种不同产地当归中的香豆素含量进行定量分析，为当归基源的化学鉴别、减少药材市场流通混乱提供依据。
目前，关于香豆素类化合物的检测方法主要有高效液相色谱法[1416]、液相色谱 质谱法[1719]、气相色谱法[20]、气相色谱质谱法[2122]、毛细管电色谱法[23]、毛细管电泳法[24]、微分脉冲伏安法[25]等。
图1.1 香豆素化合物的结构式
香豆素类化合物有强烈的紫外发色团，因此通常采用带紫外检测器的反向高效液相色谱法来对香豆素进行定量。超高效液相色谱技术与传统的液相色谱技术相比，可大幅改善液相色谱的分析速度、分离效率、样品通量和灵敏度。高效液相色谱法（HPLC）在香豆素类物质的检测中，，常配以二极管阵列检测器（DAD）[18]或紫外检测器（UV）[19]，选择合适的色谱柱、流动相及检测波长，是实现分离的关键因素。目前在检测香豆素时广泛使用的是反相C18柱。 流动相一般选择甲醇、乙腈、水和冰醋酸等，并针对不同的物质选择不同配比的流动相。席海为等[20]建立了一种同时测试都梁滴丸中5甲基补骨脂素、欧前胡素和异欧前胡素含量的HPLCUV方法。三种物质的检测波长依次为330，230和210 nm。三种物质的RSD分别为2.89%，0.31%和2.45%，适用于药品的检验工作。
液相色谱质谱法在单纯高效液相色谱的基础上发展起来的液质联用技术，能够充分发挥超高效液相色谱的高速、高分离度与质谱的高分辨率、高准确度的优势，利用特征的分子离子及其碎片离子的精确质量信息，为目标化合物的定性与定量分析提供了可靠依据。在使用此法的研究报告中，香豆素都是作为复杂混合物的一个或几个组分被检出的[26]。电子喷雾电离质谱法来检测香豆素及其裂解方式也有很多报道[27] 。但需要注意的是，液相色谱与质谱的接口不容易实现顺利对接，必须经过适当的溶剂挥发过程，这在一定程度上限制了可分析物质的种类。
前胡素和前胡醇在韩国当归的总量分别超过3%，2.5%，这使得对其他香豆素类化合物的同步定量变得困难，采用HPLC法对当归中多种香豆素同步定量几乎未见报道。由于前胡素和前胡醇是同分异构体，其色谱峰难以区分，故可采用缓冲溶液对二者进行分离 [2829]。然而， 采用了非挥发盐溶液的HPLC系统就不能够连接质谱检测器。
本研究拟使用一种带有二极管阵列检测器（DAD）的HPLC法来分离出当归根中的香豆素，对于不同保留时间的出峰采用电子喷雾电离多级串联质谱进行鉴定。对于DAD检测器无法定量的香豆素可以采用HPLCESI/MS在选择性离子探测或选择性离子反应监测模式下进行。
2实验
2.1仪器与设备
Agilent 1200型高效液相色谱仪（配备自动进样器、柱温箱、二级泵和脱气装置）， 二极管阵列（DAD）检测器（紫外检测波长为210 nm、230 nm、330 nm），Agilent 6220型质谱仪（电离方式为电子喷雾，离子检测限的m/z为2000）。
2.2试剂与药品
乙腈，水，甲醇；九种香豆素（紫花前胡苷，前胡精，紫花前胡醇，前胡醇，7羟基香豆素，脱甲基软木花香素，前胡素，紫花前胡醇当归酯，异前胡醚）标准品。所有试剂均为色谱纯。
六种商品当归，编号为R1R6，经商贸学院雷国莲教授鉴定为正品，其中R1、R2、R3购自云南，R4、R5、R6购自广东。
2.3标准溶液和样品的制备
将九种香豆素标准品用色谱级的甲醇稀释一定倍数，制备标准储备液。对各标准溶液加入等体积甲醇进行逐步稀释，使其最终的浓度分别为500、 250、 100、50、 25、 12.5、 6.25、 3.13、 1.56、 0.781、 0.390、 0.195、 0.098μg/ml。以标准溶液的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标作图，得到各香豆素标准品的工作曲线。
将当归根研磨成均匀的细粉后进行
1绪论
2实验
2.1仪器与设备 4
2.2试剂与药品 4
2.3标准溶液和样品的制备 4
3结果与讨论
3.1 HPLCDAD工作条件的确定 5
3.2 HPLCDAD检测方法的建立 6
3.2.1线性范围考察 6
3.2.2特征峰解析 6
3.2.3精密度与准确度 7
3.2.4灵敏度 7
3.3商品当归的HPLCDAD分析 7
3.4商品当归的HPLCESI/MS分析 9
4结论
参考文献 13
致谢 15
1绪论
伞形科当归属植物是传统的草药，广泛用于治疗痛经月经不调，更年期综合症、贫血、腹痛、偏头痛和关节炎[1]，还可用于安胎助产，其主要成分是前胡素和前胡醇两种香豆素。前胡素和前胡醇这两种香豆素能够显著提高培养基中大鼠皮质细胞对谷氨酸酯诱导产生的神经毒性的抵抗能力[24]，与紫花前胡苷配合使用还能改善体内东莨菪碱诱发的健忘症[56]。前胡素还具有对人类前列腺癌细胞、人类K562红白血病和U937髓白血病细胞的抗癌活性[710]。
当归作为一种重要的传统草药，也是一种对妇女具有卫生保健功能的食材，在亚洲和欧洲备受关注[1112]。虽然中、日、韩三个国家的药典中均有当归收载，但其基源各不相同，《中国药典》记载的当归为伞形科
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
产生的神经毒性的抵抗能力[24]，与紫花前胡苷配合使用还能改善体内东莨菪碱诱发的健忘症[56]。前胡素还具有对人类前列腺癌细胞、人类K562红白血病和U937髓白血病细胞的抗癌活性[710]。
当归作为一种重要的传统草药，也是一种对妇女具有卫生保健功能的食材，在亚洲和欧洲备受关注[1112]。虽然中、日、韩三个国家的药典中均有当归收载，但其基源各不相同，《中国药典》记载的当归为伞形科植物当归Angelica sinesis(Oliv.) Diels的干燥根，《日本药方局》记载的为伞形科当归属东当归Angelicae Acutiloba(Sieb. et Zucc.) Kitagawa的干燥根，《韩国药典》记载的为伞形科当归属朝鲜当归Angelica gigas Nakai的干燥根[12.13]。韩国当归的花色为深紫色，中国和日本当归的花色为白色。文献报道[13]中日两国当归中所含主要成分和功能较相似，为苯酚类物质，具有补血活血、解痉止痛作用，而韩国当归以紫花前胡醇当归酯、紫花前胡醇、紫花前胡苷为主要成分，因此香豆素类化合物可以用作区分韩国当归和中、日当归的标识物。
当归根中的香豆素共有9种，分别为紫花前胡苷，前胡精，紫花前胡醇，前胡醇，7羟基香豆素，脱甲基软木花香素，前胡素，紫花前胡醇当归酯，异前胡醚，其结构如图1.1所示。通过对三种不同产地当归中的香豆素含量进行定量分析，为当归基源的化学鉴别、减少药材市场流通混乱提供依据。
目前，关于香豆素类化合物的检测方法主要有高效液相色谱法[1416]、液相色谱 质谱法[1719]、气相色谱法[20]、气相色谱质谱法[2122]、毛细管电色谱法[23]、毛细管电泳法[24]、微分脉冲伏安法[25]等。
图1.1 香豆素化合物的结构式
香豆素类化合物有强烈的紫外发色团，因此通常采用带紫外检测器的反向高效液相色谱法来对香豆素进行定量。超高效液相色谱技术与传统的液相色谱技术相比，可大幅改善液相色谱的分析速度、分离效率、样品通量和灵敏度。高效液相色谱法（HPLC）在香豆素类物质的检测中，，常配以二极管阵列检测器（DAD）[18]或紫外检测器（UV）[19]，选择合适的色谱柱、流动相及检测波长，是实现分离的关键因素。目前在检测香豆素时广泛使用的是反相C18柱。 流动相一般选择甲醇、乙腈、水和冰醋酸等，并针对不同的物质选择不同配比的流动相。席海为等[20]建立了一种同时测试都梁滴丸中5甲基补骨脂素、欧前胡素和异欧前胡素含量的HPLCUV方法。三种物质的检测波长依次为330，230和210 nm。三种物质的RSD分别为2.89%，0.31%和2.45%，适用于药品的检验工作。
液相色谱质谱法在单纯高效液相色谱的基础上发展起来的液质联用技术，能够充分发挥超高效液相色谱的高速、高分离度与质谱的高分辨率、高准确度的优势，利用特征的分子离子及其碎片离子的精确质量信息，为目标化合物的定性与定量分析提供了可靠依据。在使用此法的研究报告中，香豆素都是作为复杂混合物的一个或几个组分被检出的[26]。电子喷雾电离质谱法来检测香豆素及其裂解方式也有很多报道[27] 。但需要注意的是，液相色谱与质谱的接口不容易实现顺利对接，必须经过适当的溶剂挥发过程，这在一定程度上限制了可分析物质的种类。
前胡素和前胡醇在韩国当归的总量分别超过3%，2.5%，这使得对其他香豆素类化合物的同步定量变得困难，采用HPLC法对当归中多种香豆素同步定量几乎未见报道。由于前胡素和前胡醇是同分异构体，其色谱峰难以区分，故可采用缓冲溶液对二者进行分离 [2829]。然而， 采用了非挥发盐溶液的HPLC系统就不能够连接质谱检测器。
本研究拟使用一种带有二极管阵列检测器（DAD）的HPLC法来分离出当归根中的香豆素，对于不同保留时间的出峰采用电子喷雾电离多级串联质谱进行鉴定。对于DAD检测器无法定量的香豆素可以采用HPLCESI/MS在选择性离子探测或选择性离子反应监测模式下进行。
2实验
2.1仪器与设备
Agilent 1200型高效液相色谱仪（配备自动进样器、柱温箱、二级泵和脱气装置）， 二极管阵列（DAD）检测器（紫外检测波长为210 nm、230 nm、330 nm），Agilent 6220型质谱仪（电离方式为电子喷雾，离子检测限的m/z为2000）。
2.2试剂与药品
乙腈，水，甲醇；九种香豆素（紫花前胡苷，前胡精，紫花前胡醇，前胡醇，7羟基香豆素，脱甲基软木花香素，前胡素，紫花前胡醇当归酯，异前胡醚）标准品。所有试剂均为色谱纯。
六种商品当归，编号为R1R6，经商贸学院雷国莲教授鉴定为正品，其中R1、R2、R3购自云南，R4、R5、R6购自广东。
2.3标准溶液和样品的制备
将九种香豆素标准品用色谱级的甲醇稀释一定倍数，制备标准储备液。对各标准溶液加入等体积甲醇进行逐步稀释，使其最终的浓度分别为500、 250、 100、50、 25、 12.5、 6.25、 3.13、 1.56、 0.781、 0.390、 0.195、 0.098μg/ml。以标准溶液的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标作图，得到各香豆素标准品的工作曲线。
将当归根研磨成均匀的细粉后进行
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