凹叶厚朴内生真菌产厚朴酚的发酵条件优化(附件)
摘 要凹叶厚朴为木兰科落叶乔木，是胃肠道疾病常用的中药，具有燥湿消痰、下气除满的功效。内生真菌能够产生与宿主细胞相同或者相似的代谢产物，但含量较低，不能用于实际生产。以提高内生真菌代谢产物含量为目标，对其发酵条件进行优化，应用于实际化生产。本实验以厚朴酚为检测指标，利用高效液相色谱法(HPLC)进行含量检测，筛选确定凹叶厚朴内生真菌发酵条件，采用单因素试验得出最佳发酵优化的碳源、氮源、生长因子，结果表明最佳碳源为蔗糖40.0 g/l，最佳氮源为硝酸铵5.0 g/l，最佳生长因子为赤霉素0.04 g/l，为后续优化条件提供依据。 目 录
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴植物的简介 1
1.2 植物内生真菌 1
1.3 内生真菌研究进展 1
1.4 内生真菌发酵条件 2
1.4.1 碳源 2
1.4.2 氮源 3
1.4.3 生长因子 4
1.5 凹叶厚朴内生真菌发酵条件 4
2 实验部分
2.1 实验材料 5
2.1.1 菌种来源 5
2.1.2 实验仪器设备 5
2.1.3 试剂和药品 5
2.2 单因素试验 6
2.2.1 基础培养基 6
2.2.2 最适碳源的筛选 7
2.2.3 最适氮源的筛选 7
2.2.4 最适生长因子的筛选 7
2.3 单因素实验含量测定 7
2.3.1 仪器、药品与试剂 7
2.3.2 色谱条件和系统适用性试验 7
2.3.3 对照品溶液的制备 7
2.3.4 供试品溶液的制备 8
2.3.5 测定方法 8
2.3.6 标准曲线的制备 9
2.3.7 精密度试验 9
2.3.8 稳定性试验 9
2.3.9 重复性试验 10
2.3.10 样品测定结果 11
2.4 分析讨论 13
结论 15
参考文献 16
供试品溶液的制备 8
2.3.5 测定方法 8
2.3.6 标准曲线的制备 9
2.3.7 精密度试验 9
2.3.8 稳定性试验 9
2.3.9 重复性试验 10
2.3.10 样品测定结果 11
2.4 分析讨论 13
结论 15
参考文献 16
致谢 19
文献综述
凹叶厚朴植物的简介
凹叶厚朴（Magnolia officinalis Rehd.etWils.var.bilobaRehd.et Wils）为木兰科落叶乔木，以其干燥的干皮、根皮及枝皮入药，是胃肠道疾病常用的中药，具有温中下气、化湿引滞的功效。其主要成分是厚朴酚与和厚朴酚。
凹叶厚朴药性为苦、辛、温。归脾、胃、肺、大肠经；有燥湿祛痰、下气除满的功效[1]。另含厚朴酚(magnolol)约5%，有抗菌作用，及其异构体和厚朴酚(honokiol)。此外尚含三羟基厚朴酚、去氢三羟基厚朴酚、木兰箭毒碱、氧化黄心树宁碱及鞣质[2]。2015年版《中国药典》将厚朴酚及和厚朴酚的含量作为厚朴的质量控制指标[3]。不同剂量的厚朴酚、和厚朴酚可以减少稀便率和小鼠腹泻指数，抑制由硫酸新斯的明引起的小肠机能亢进小鼠，显示和厚朴酚有抗腹泻作用[4]。厚朴酚对实验性胃溃疡有防治作用。厚朴有降压作用，降压时反射性的引起呼吸兴奋，心率增加[1]。
植物内生真菌
高等植物不仅有自己特定的分类，且数量繁多，约有数十万种，每一种都不是单一的个体，其中还包括许多内生物，才组成了一个复杂的共生体。内生真菌(Endophytes)当属于植物体内最主要的生物类群，几乎所有的植物组织中都含有内生真菌。药用植物最主要的来源还是植物本身，内生真菌广泛分布于药用植物体内[5]。
内生真菌(endophytic fungus)是指那些在其生活史中的某一段时期内生活在植物组织内部，不引起植物明显症状改变的菌，普遍存在于目前已研究过的各种水生及陆生植物中，几乎每种植物都有内生菌存在。有人从来源不同的三种厚朴中共提取出内生真菌[6]，足以证明厚朴内生真菌在植物界中有很多。内生真菌代谢产物含有厚朴酚及和厚朴酚，挥发油等[7]。
内生真菌研究进展
研究表明，内生真菌代谢产物有抗肿瘤活性，抗菌活性等等。Gary和Strobe1从欧洲红豆杉内生真菌产顶孢属，可以产生一系列的抗真菌活性，抗癌肽物质，包括石膏抑菌元素可以让一些人类肿瘤细胞有很好的抑制作用研究表明内生菌代谢产物有抗肿瘤活性，抗生素活性，抗菌，抗病毒等作用[8]。Strobel团队从卫矛科雷公藤的药用植物内生真菌分离出可以产生一种新型的环肽抗生素cryptocandin。美国蒙大拿州立大学的Strobel小组在短叶红豆杉内生真菌Taxomyces and reanae中发现紫杉醇[9]，国内外掀起对药用植物和濒危植物内生真菌的研究热潮[10]，大多数的研究工作是对温带地区和亚热带地区具有重要经济价值的植物，最近有一些研究工作在热带地区。Castillo发现K.nigriscans内生链霉菌属菌株能产生一种活性多肽Munumbicins，这种肽具有广泛的抗菌活性。寄生虫和病原菌的耐药性，也具有很好的抑制作用[11]。利用内生菌的次生代谢物质开发新的药物将是今后医药方面的研究方向。现在，内生真菌研究涉及高等植物不仅具有重要的经济价值，还包括孢子植物如苔藓、蕨类和地衣[12]。
内生真菌生活在植物体内，与植物体共生，在吸收植物体营养物质的同时也维系着宿主植物正常的生理活性。内生真菌不可避免有一定的微生物学特性，便会在生长过程中分泌大量的代谢产物。这些代谢产物种类丰富，天然化合物中涉及到的在这些代谢产物中几乎都有，主要有苯丙素类化合物、醌类化合物、黄酮类化合物、萜类化合物和挥发油、甾体及苷类化合物、生物碱类化合物、多肽和环类化合物等[13]。
内生真菌发酵条件
生成次级代谢产物是由很多影响因素来控制的，比如碳源，氮源，微量元素，生长因子等[14]。选择发酵培养基作为基础培养基，采用单因素优化试验，筛选出最佳的营养物质（碳源，氮源，生长因子)，最终确定筛选出菌株的最适发酵条件。
碳源
糖类的成分对内生真菌的生长代谢有一定的影响。徐峰等[15]对生产紫杉醇的南方红豆杉内生真菌发酵菌种改良和优化，选择的碳源是葡萄糖，蔗糖，选择最好的碳源是葡萄糖。张亚妮等[16]对产紫杉醇发酵条件的研究，选择的碳源有葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，筛选出最佳碳源为蔗糖。赵赟鑫等[17]对红豆杉内生真菌产紫杉醇的发酵培养条件优化，选择的碳源有葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，淀粉，最适碳源为葡萄糖。葛飞等[18]对SG0016菌株的营养物质等发酵培养条件进行优化，葡萄糖为碳源，酵母膏为氮源。赵银娟等[19]对粘质沙雷氏菌NJZT1产灵菌红素培养条件的优化，选择的碳源有葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，淀粉，筛选出最佳碳源为淀粉。于哲等[20]对鱼腥草内生放线菌F03培养条件的优化，选择的碳源有蔗糖，葡萄糖，麦芽糖和可溶性淀粉，筛选出最佳碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨。刘宽博等[21]对抗单增李斯特菌枯草芽孢菌C3增菌培养条件优化，碳源选择的有葡糖糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，最佳碳源为葡糖糖。耿振香等[22]对活性污泥中絮凝剂产生菌的筛选及培养条件优化，筛选出最适的碳源为葡萄糖，最适的氮源为尿素。龚光禄等[23]对红托煮荪培养基及培养基条件优化，筛选出葡萄糖，果糖为适宜的碳源。张海等[24]对高效絮凝剂产生菌的分离选育及培养条件优化，选择的的碳源有葡萄糖，乳糖，淀粉，蔗糖，最佳碳源为葡萄糖。邱连芳等[25]对产番茄红素
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴植物的简介 1
1.2 植物内生真菌 1
1.3 内生真菌研究进展 1
1.4 内生真菌发酵条件 2
1.4.1 碳源 2
1.4.2 氮源 3
1.4.3 生长因子 4
1.5 凹叶厚朴内生真菌发酵条件 4
2 实验部分
2.1 实验材料 5
2.1.1 菌种来源 5
2.1.2 实验仪器设备 5
2.1.3 试剂和药品 5
2.2 单因素试验 6
2.2.1 基础培养基 6
2.2.2 最适碳源的筛选 7
2.2.3 最适氮源的筛选 7
2.2.4 最适生长因子的筛选 7
2.3 单因素实验含量测定 7
2.3.1 仪器、药品与试剂 7
2.3.2 色谱条件和系统适用性试验 7
2.3.3 对照品溶液的制备 7
2.3.4 供试品溶液的制备 8
2.3.5 测定方法 8
2.3.6 标准曲线的制备 9
2.3.7 精密度试验 9
2.3.8 稳定性试验 9
2.3.9 重复性试验 10
2.3.10 样品测定结果 11
2.4 分析讨论 13
结论 15
参考文献 16
供试品溶液的制备 8
2.3.5 测定方法 8
2.3.6 标准曲线的制备 9
2.3.7 精密度试验 9
2.3.8 稳定性试验 9
2.3.9 重复性试验 10
2.3.10 样品测定结果 11
2.4 分析讨论 13
结论 15
参考文献 16
致谢 19
文献综述
凹叶厚朴植物的简介
凹叶厚朴（Magnolia officinalis Rehd.etWils.var.bilobaRehd.et Wils）为木兰科落叶乔木，以其干燥的干皮、根皮及枝皮入药，是胃肠道疾病常用的中药，具有温中下气、化湿引滞的功效。其主要成分是厚朴酚与和厚朴酚。
凹叶厚朴药性为苦、辛、温。归脾、胃、肺、大肠经；有燥湿祛痰、下气除满的功效[1]。另含厚朴酚(magnolol)约5%，有抗菌作用，及其异构体和厚朴酚(honokiol)。此外尚含三羟基厚朴酚、去氢三羟基厚朴酚、木兰箭毒碱、氧化黄心树宁碱及鞣质[2]。2015年版《中国药典》将厚朴酚及和厚朴酚的含量作为厚朴的质量控制指标[3]。不同剂量的厚朴酚、和厚朴酚可以减少稀便率和小鼠腹泻指数，抑制由硫酸新斯的明引起的小肠机能亢进小鼠，显示和厚朴酚有抗腹泻作用[4]。厚朴酚对实验性胃溃疡有防治作用。厚朴有降压作用，降压时反射性的引起呼吸兴奋，心率增加[1]。
植物内生真菌
高等植物不仅有自己特定的分类，且数量繁多，约有数十万种，每一种都不是单一的个体，其中还包括许多内生物，才组成了一个复杂的共生体。内生真菌(Endophytes)当属于植物体内最主要的生物类群，几乎所有的植物组织中都含有内生真菌。药用植物最主要的来源还是植物本身，内生真菌广泛分布于药用植物体内[5]。
内生真菌(endophytic fungus)是指那些在其生活史中的某一段时期内生活在植物组织内部，不引起植物明显症状改变的菌，普遍存在于目前已研究过的各种水生及陆生植物中，几乎每种植物都有内生菌存在。有人从来源不同的三种厚朴中共提取出内生真菌[6]，足以证明厚朴内生真菌在植物界中有很多。内生真菌代谢产物含有厚朴酚及和厚朴酚，挥发油等[7]。
内生真菌研究进展
研究表明，内生真菌代谢产物有抗肿瘤活性，抗菌活性等等。Gary和Strobe1从欧洲红豆杉内生真菌产顶孢属，可以产生一系列的抗真菌活性，抗癌肽物质，包括石膏抑菌元素可以让一些人类肿瘤细胞有很好的抑制作用研究表明内生菌代谢产物有抗肿瘤活性，抗生素活性，抗菌，抗病毒等作用[8]。Strobel团队从卫矛科雷公藤的药用植物内生真菌分离出可以产生一种新型的环肽抗生素cryptocandin。美国蒙大拿州立大学的Strobel小组在短叶红豆杉内生真菌Taxomyces and reanae中发现紫杉醇[9]，国内外掀起对药用植物和濒危植物内生真菌的研究热潮[10]，大多数的研究工作是对温带地区和亚热带地区具有重要经济价值的植物，最近有一些研究工作在热带地区。Castillo发现K.nigriscans内生链霉菌属菌株能产生一种活性多肽Munumbicins，这种肽具有广泛的抗菌活性。寄生虫和病原菌的耐药性，也具有很好的抑制作用[11]。利用内生菌的次生代谢物质开发新的药物将是今后医药方面的研究方向。现在，内生真菌研究涉及高等植物不仅具有重要的经济价值，还包括孢子植物如苔藓、蕨类和地衣[12]。
内生真菌生活在植物体内，与植物体共生，在吸收植物体营养物质的同时也维系着宿主植物正常的生理活性。内生真菌不可避免有一定的微生物学特性，便会在生长过程中分泌大量的代谢产物。这些代谢产物种类丰富，天然化合物中涉及到的在这些代谢产物中几乎都有，主要有苯丙素类化合物、醌类化合物、黄酮类化合物、萜类化合物和挥发油、甾体及苷类化合物、生物碱类化合物、多肽和环类化合物等[13]。
内生真菌发酵条件
生成次级代谢产物是由很多影响因素来控制的，比如碳源，氮源，微量元素，生长因子等[14]。选择发酵培养基作为基础培养基，采用单因素优化试验，筛选出最佳的营养物质（碳源，氮源，生长因子)，最终确定筛选出菌株的最适发酵条件。
碳源
糖类的成分对内生真菌的生长代谢有一定的影响。徐峰等[15]对生产紫杉醇的南方红豆杉内生真菌发酵菌种改良和优化，选择的碳源是葡萄糖，蔗糖，选择最好的碳源是葡萄糖。张亚妮等[16]对产紫杉醇发酵条件的研究，选择的碳源有葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，筛选出最佳碳源为蔗糖。赵赟鑫等[17]对红豆杉内生真菌产紫杉醇的发酵培养条件优化，选择的碳源有葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，淀粉，最适碳源为葡萄糖。葛飞等[18]对SG0016菌株的营养物质等发酵培养条件进行优化，葡萄糖为碳源，酵母膏为氮源。赵银娟等[19]对粘质沙雷氏菌NJZT1产灵菌红素培养条件的优化，选择的碳源有葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，淀粉，筛选出最佳碳源为淀粉。于哲等[20]对鱼腥草内生放线菌F03培养条件的优化，选择的碳源有蔗糖，葡萄糖，麦芽糖和可溶性淀粉，筛选出最佳碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨。刘宽博等[21]对抗单增李斯特菌枯草芽孢菌C3增菌培养条件优化，碳源选择的有葡糖糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，最佳碳源为葡糖糖。耿振香等[22]对活性污泥中絮凝剂产生菌的筛选及培养条件优化，筛选出最适的碳源为葡萄糖，最适的氮源为尿素。龚光禄等[23]对红托煮荪培养基及培养基条件优化，筛选出葡萄糖，果糖为适宜的碳源。张海等[24]对高效絮凝剂产生菌的分离选育及培养条件优化，选择的的碳源有葡萄糖，乳糖，淀粉，蔗糖，最佳碳源为葡萄糖。邱连芳等[25]对产番茄红素
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