hplcms法测定绞股蓝中叶绿素及其衍生物(附件)
摘 要绞股蓝是东方人常用于治疗慢性病的一种传统中草药，已被证实具有多种至关重要的生物活性，如抗癌、消炎和护肝等。绞股蓝中的功能性成分黄酮类、皂苷类、类胡萝卜素和叶绿素等是其治病疗效的关键。本文通过建立一种HPLC-MS方法来测定绞股蓝中叶绿素及其衍生物的含量。首先从绞股蓝中提取叶绿素及其衍生物，其次再运用HPLC法对提取物各组分进行分离，通过比较保留时间以及吸收谱及MS法的辅助来对各组分进行识别，最后我们定量计算各组分的含量，根据数据与谱图分析对实验方法进行评价。研究结果表明HPLC-MS方法重复性好、回收率高，可作为绞股蓝叶绿素及其衍生物含量快速测定的有效方法；测定结果显示，绞股蓝中叶绿素及其衍生物的总含量占绞股蓝重的 3%左右，表明绞股蓝中含有丰富的天然叶绿素。 目 录
1 绪论
1.1 绞股蓝概述 1
1.1.1 绞股蓝的药用价值 1
1.1.2 绞股蓝的食用价值 1
1.1.3 绞股蓝的化学成分 2
1.2 叶绿素概述 2
1.2.1 叶绿素的作用 3
1.2.2 叶绿素的提取和测定 4
1.3 HPLCMS的应用 5
1.3.1 HPLCMS技术介绍 6
1.3.2 HPLCMS在中药定量研究的应用 7
1.4 本课题主要研究内容 8
2 材料与实验设计
2.1 实验材料 9
2.1.1 实验仪器 9
2.1.2 实验药品 9
2.2 实验方法 9
2.2.1 标准溶液的配制 9
2.2.2 检验仪器条件 10
2.2.3 样品前处理 10
3 实验结果分析
3.1 测定方法的确定 11
3.1.1 色谱条件的选择 11
3.1.2 质谱条件的优化 14
3.1.3 叶绿素的高分辨质谱鉴别 14
3.2 提取条件的优化 16
3.3 方法学考察 16
3.3.1 标准曲线的绘制及检出限 16
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
3 实验结果分析
3.1 测定方法的确定 11
3.1.1 色谱条件的选择 11
3.1.2 质谱条件的优化 14
3.1.3 叶绿素的高分辨质谱鉴别 14
3.2 提取条件的优化 16
3.3 方法学考察 16
3.3.1 标准曲线的绘制及检出限 16
3.3.2 精密度 17
3.3.3 重复性 17
3.3.4 稳定性 17
3.3.5 回收率 18
3.4 叶绿素及其衍生物的测定 18
4 总结 19
参考文献 20
致 谢 22
1 绪论
1.1 绞股蓝概述
绞股蓝 Gynostemma pentaphyllum（Thunb）Makino，它的学名被称为七叶胆。在每个国家的名字又是不一样的，比如在我国是叫绞股蓝而在日本则被称为甘茶蔓。它主要生长在亚热带，而在我国则主要分布在秦岭以及长江流域以南的省区[1]。目前全球有绞股蓝 17 种，我国有15 种，其中9 种是我国所特有[2]。在《本草纲目》中就有关于绞股蓝的记载，可以看出它在我国的源远流长。
绞股蓝在我国因资源丰富得到大力研究与发展。1986 年，国家新药评定委员会通过了绞股蓝总皂苷片及绞股蓝总苷原料药两种新药的审定，并颁发了新药证书。而这也正是绞股蓝作为新药首次得到了国家药症部门的审批后上市，从而引发了全国科研工作者的研究热情。就在当年，国家科委又将其列入“星火计划”，以此作为国家研究开发的项目并给予大力支持。
1.1.1 绞股蓝的药用价值
根据临床研究发现，它不仅可以治疗慢性支气管炎、咳嗽、便秘等并且还可以当做饭菜食用。具有很高的药用价值。根据《本草纲目》的记载早在那时就已经将绞股蓝入药。那么对于日本而言，日本绞股蓝往往用于日常生活，如泡茶等，而对于糖尿病人则往往采用绞股蓝去代替甜品，这是因为日本的绞股蓝大多是甜味。那么，到目前为止随着人们对绞股蓝的研究越来越深入，我们也发现绞股蓝在提高机体整体免疫能力、调节神经、治疗心血管疾病、延长细胞寿命，降低血脂、抗溃疡、消除药物毒副作用、维持内分泌系统的机能等诸多方面都有着广泛的用途，因此合理的使用绞股蓝来治疗疾病对于人们而言是既经济又有效。
1.1.2 绞股蓝的食用价值
绞股蓝在上文中提到过在明代时期人们把它当做饭菜来进行食用，但是根据研究泡着喝能够最大限度的释放它的营养价值，对于患有高血压高血脂的病人可以说是一种最佳的食用方法。因此目前我国大部分的地区都会把它直接加工成茶叶来进行出售。在绞股蓝的产地，很多当地人常常将其作为凉菜食用又或者在煮粥的时候加入。
1.1.3 绞股蓝的化学成分
（1）皂甙
由于皂甙有很多种类，就目前而言可以分离出来的就已经高达84种，而在绞股蓝中则是最多的一类，并且有很多种和人参皂甙的结构基本相同。所以人们在分析绞股蓝皂甙时通常多用人参皂甙来做对照品。这些和人参皂甙相似的绞股蓝皂甙均为均为四环三萜达玛烷型，他们和人参皂甙中的 Rb1 非常相似。
（2）氨基酸
我们都知道在人体当中氨基酸起着非常重要的作用，绞股蓝之所以具有治疗咳嗽的功能就是因为其中含有天门冬氨酸。并且在绞股蓝中发现了不止一种对人体有益的氨基酸。
（3）其他化学成分
各种研究表明绞股蓝中所含有的化学成分除了有上述的皂甙和氨基酸类外还有多糖、蛋白质、黄酮、生物碱和有机酸等等[3]。近年来国内外的学者也都对绞股蓝做了深入的研究发现其中含有钾、钠、钙、磷、胡萝卜素、各种维生素等等。对于绞股蓝来说生长于不同的地方以及它所处的环境都会使得它的皂甙、多糖等元素的含量产生变化，比如说在绞股蓝中皂甙含量最多的是九叶绞股蓝。从地区来看皖东地区的绞股蓝质量要好。
1.2 叶绿素概述
叶绿素其实就是一种与光合作用有关的的重要色素[4]，它存在于所有能够进行光合作用的生物体，包括一些绿色植物、藻类。它主要的作用就是通过将二氧化碳转化成为碳水化合物来便于吸收。叶绿素主要是美卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等[5]。
1.2.1 叶绿素的作用
对于植物来说叶绿素就相当于人体中的血液，叶绿素的分子结构和血红素是非常相似的，叶绿素中的中心原子是镁，而血红素则是铁，依据这个原理则可以推出叶绿素对人体也有好处的，叶绿素的摄入可以增加身
1 绪论
1.1 绞股蓝概述 1
1.1.1 绞股蓝的药用价值 1
1.1.2 绞股蓝的食用价值 1
1.1.3 绞股蓝的化学成分 2
1.2 叶绿素概述 2
1.2.1 叶绿素的作用 3
1.2.2 叶绿素的提取和测定 4
1.3 HPLCMS的应用 5
1.3.1 HPLCMS技术介绍 6
1.3.2 HPLCMS在中药定量研究的应用 7
1.4 本课题主要研究内容 8
2 材料与实验设计
2.1 实验材料 9
2.1.1 实验仪器 9
2.1.2 实验药品 9
2.2 实验方法 9
2.2.1 标准溶液的配制 9
2.2.2 检验仪器条件 10
2.2.3 样品前处理 10
3 实验结果分析
3.1 测定方法的确定 11
3.1.1 色谱条件的选择 11
3.1.2 质谱条件的优化 14
3.1.3 叶绿素的高分辨质谱鉴别 14
3.2 提取条件的优化 16
3.3 方法学考察 16
3.3.1 标准曲线的绘制及检出限 16
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
3 实验结果分析
3.1 测定方法的确定 11
3.1.1 色谱条件的选择 11
3.1.2 质谱条件的优化 14
3.1.3 叶绿素的高分辨质谱鉴别 14
3.2 提取条件的优化 16
3.3 方法学考察 16
3.3.1 标准曲线的绘制及检出限 16
3.3.2 精密度 17
3.3.3 重复性 17
3.3.4 稳定性 17
3.3.5 回收率 18
3.4 叶绿素及其衍生物的测定 18
4 总结 19
参考文献 20
致 谢 22
1 绪论
1.1 绞股蓝概述
绞股蓝 Gynostemma pentaphyllum（Thunb）Makino，它的学名被称为七叶胆。在每个国家的名字又是不一样的，比如在我国是叫绞股蓝而在日本则被称为甘茶蔓。它主要生长在亚热带，而在我国则主要分布在秦岭以及长江流域以南的省区[1]。目前全球有绞股蓝 17 种，我国有15 种，其中9 种是我国所特有[2]。在《本草纲目》中就有关于绞股蓝的记载，可以看出它在我国的源远流长。
绞股蓝在我国因资源丰富得到大力研究与发展。1986 年，国家新药评定委员会通过了绞股蓝总皂苷片及绞股蓝总苷原料药两种新药的审定，并颁发了新药证书。而这也正是绞股蓝作为新药首次得到了国家药症部门的审批后上市，从而引发了全国科研工作者的研究热情。就在当年，国家科委又将其列入“星火计划”，以此作为国家研究开发的项目并给予大力支持。
1.1.1 绞股蓝的药用价值
根据临床研究发现，它不仅可以治疗慢性支气管炎、咳嗽、便秘等并且还可以当做饭菜食用。具有很高的药用价值。根据《本草纲目》的记载早在那时就已经将绞股蓝入药。那么对于日本而言，日本绞股蓝往往用于日常生活，如泡茶等，而对于糖尿病人则往往采用绞股蓝去代替甜品，这是因为日本的绞股蓝大多是甜味。那么，到目前为止随着人们对绞股蓝的研究越来越深入，我们也发现绞股蓝在提高机体整体免疫能力、调节神经、治疗心血管疾病、延长细胞寿命，降低血脂、抗溃疡、消除药物毒副作用、维持内分泌系统的机能等诸多方面都有着广泛的用途，因此合理的使用绞股蓝来治疗疾病对于人们而言是既经济又有效。
1.1.2 绞股蓝的食用价值
绞股蓝在上文中提到过在明代时期人们把它当做饭菜来进行食用，但是根据研究泡着喝能够最大限度的释放它的营养价值，对于患有高血压高血脂的病人可以说是一种最佳的食用方法。因此目前我国大部分的地区都会把它直接加工成茶叶来进行出售。在绞股蓝的产地，很多当地人常常将其作为凉菜食用又或者在煮粥的时候加入。
1.1.3 绞股蓝的化学成分
（1）皂甙
由于皂甙有很多种类，就目前而言可以分离出来的就已经高达84种，而在绞股蓝中则是最多的一类，并且有很多种和人参皂甙的结构基本相同。所以人们在分析绞股蓝皂甙时通常多用人参皂甙来做对照品。这些和人参皂甙相似的绞股蓝皂甙均为均为四环三萜达玛烷型，他们和人参皂甙中的 Rb1 非常相似。
（2）氨基酸
我们都知道在人体当中氨基酸起着非常重要的作用，绞股蓝之所以具有治疗咳嗽的功能就是因为其中含有天门冬氨酸。并且在绞股蓝中发现了不止一种对人体有益的氨基酸。
（3）其他化学成分
各种研究表明绞股蓝中所含有的化学成分除了有上述的皂甙和氨基酸类外还有多糖、蛋白质、黄酮、生物碱和有机酸等等[3]。近年来国内外的学者也都对绞股蓝做了深入的研究发现其中含有钾、钠、钙、磷、胡萝卜素、各种维生素等等。对于绞股蓝来说生长于不同的地方以及它所处的环境都会使得它的皂甙、多糖等元素的含量产生变化，比如说在绞股蓝中皂甙含量最多的是九叶绞股蓝。从地区来看皖东地区的绞股蓝质量要好。
1.2 叶绿素概述
叶绿素其实就是一种与光合作用有关的的重要色素[4]，它存在于所有能够进行光合作用的生物体，包括一些绿色植物、藻类。它主要的作用就是通过将二氧化碳转化成为碳水化合物来便于吸收。叶绿素主要是美卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等[5]。
1.2.1 叶绿素的作用
对于植物来说叶绿素就相当于人体中的血液，叶绿素的分子结构和血红素是非常相似的，叶绿素中的中心原子是镁，而血红素则是铁，依据这个原理则可以推出叶绿素对人体也有好处的，叶绿素的摄入可以增加身
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