王不留行多糖的DNS含量测定方法研究
目录
1 引言 1
1.1 多糖定义 1
1.2 多糖的化学结构 1
1.3 多糖的降解 1
1.4 多糖含量测定方法 1
1.5 本文研究的目的与意义 2
1.6 含量测定方法的确定 3
2 实验方法 3
2.1 试剂及仪器 3
2.2 DNS法优化 3
2.3 多糖水解方法优化 5
2.4 方法学考察 6
2.5 多糖含量测定 7
3 结果与分析 7
3.1 DNS法优化结果分析 7
3.2 葡萄糖标准曲线的制备 8
3.3 单因素实验结果分析 9
3.4 正交实验结果分析 10
3.5 方法学考察结果 11
3.6 多糖含量 11
结论 13
致谢 14
参考文献 15
1 引言
1.1 多糖定义
多糖（polysaccharides，PS）是由多个单糖通过糖苷键连接而成的高聚体，是四大生命基础物质之一[1]。
1.2 多糖的化学结构
多糖的结构单位是单糖，常见的单糖有：葡萄糖、果糖、核糖和鼠李糖等。而单糖之间以糖苷键相连接的，常见的有α-1,4-、β-1,4-、α, β-1,2-和α-1,6-糖苷键[2]。多糖水解生成单糖或者是寡糖（通过糖苷键将2-10个单糖连接而成小聚体）。
按多糖链有无分支，可将多糖分为直链多糖和支链多糖。直链多糖仅含一种糖苷键，如淀粉、糖原等；支链多糖含有多种糖苷键，如糖原、支链淀粉等。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
1.3 多糖的降解
多糖的定性、定量分析一般先将多糖降解成单糖或寡糖后再进行分析测定。常见的多糖降解方法（见表1）。
表 1 植物多糖降解方法的特点
水解方法 辅助试剂或仪器 优点 缺点
化学法 HCl、H2SO4、TFA 操作简单、反应快、水解产率高 均一性差、污染重等
物理法 微波、超声波、辐射 操作简单、可控性好、试剂使用少 收率低、成本高
生物法 生物酶 特异性、均一性好 酶价格昂贵、成本高
其中最常用方法为酸水解。利用中和、沉淀、透析等过程来消除酸的影响[3]。
1.4 多糖含量测定方法
1.4.1 苯酚-硫酸法
苯酚-硫酸法是一种常用的多糖测定方法。浓硫酸把多糖水解成单糖后并迅速脱水生成糠醛衍生物，该衍生物与苯酚作用显色，通过比色法来确定多糖含量。该法简便、快速、显色物稳定性好等优点[4]。但是有色物质会干扰多糖含量的测定。
1.4.2 蒽酮-硫酸法
多糖在经浓硫酸水解、脱水后与蒽醌形成有色物，通过测定吸光度来计算多糖含量。但是蒽酮-硫酸一般要求现配现用且避光，稳定性差。
1.4.3 3,5-二硝基水杨酸法
简称DNS法，在碱性加热的条件下，3,5-二硝基水杨酸被还原为氨基化合物，呈橘黄色，在一定的浓度范围，反应液颜色和还原糖含量之间会呈现一定的比例关系[5]。通过比色法测定样品中的含糖量。并通过公式（多糖=总糖-还原糖）来计算样品中多糖的量。此法简便、快速、适合大批量产品的检测。
1.4.4 液相色谱法
HPLC分析方法可对单糖、寡糖进行微量常量的分析。一般对糖的色谱分离时选择的流动相是乙腈和水，随着水的比例的减少糖的保留时间也随之减短[6]。而色谱柱一般采用的是氨基键合硅胶色谱柱。一般常用的检测器有示差折光检测器、蒸发光散射检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
1.4.5 薄层色谱法
简称TLC，根据吸附剂对样品组分的吸附能力的不同，以及展开剂对各组分解吸附能力的差异，使各组分从样品混合物中分离开来。TLC具有设备简单、操作简便、分离速度快等特点。李海棠等[7]采用此法测定了海康胶囊中海参多糖的含量。
1.4.6 其他方法
此外，滴定法（斐林氏滴定法、氧化还原法等）和气相色谱法也常用于糖类物质分析[8]。
化学方法测定的往往是总糖含量，但是由于操作简便、成本低等特点，仍被广泛应用。色谱法相对于化学法成本高但是灵敏度高、专属性强、准确度高。
1.5 本文研究目的与意义
王不留行是石竹科植物麦蓝菜（Vaccariasegetalis (Neck) Garcke）的干燥成熟种子，为中国药典收载药材[9]。
经研究发现王不留行提取物具有消肿敛疮，利水通淋等生物活性，所以在王不留行提取物生产加工的过程中，也常需要对提取物中的多糖进行监控和含量测定，因此选择合适的多糖分析方法十分重要。本论文就王不留行多糖的DNS含量测定方法进行研究，优化建立王不留行多糖的酸水解预处理方法和DNS含量测定方法，并进行方法学验证。
1.6 含量测定方法的确定
传统的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
多糖含量测定方法（苯酚-硫酸法等）测定步骤较繁琐，而且测定值为总糖的含量，不能消除样品中单糖的干扰，因此测得的多糖含量往往偏高。相比较而言，DNS法简便、快速、专属性强且能够消除总糖中单糖的干扰。本文研究的王不留行多糖为葡聚糖，标准品易得，因此本论文将采用DNS法进行测定多糖含量。
2 实验方法
2.1 试剂及仪器
2.1.1 试剂
表 2 实验试剂
试剂 等级 厂家
3,5-二硝基水杨酸 AR 国药集团化学试剂有限公司
四水合酒石酸钾钠 AR 江苏强盛功能化学股份有限公司
氢氧化钠 AR 上海久亿化学试剂有限公司
苯酚 AR 上海久亿化学试剂有限公司
无水亚硫酸钠 AR 上海久亿化学试剂有限公司
无水乙醇 AR 江苏强盛功能化学股份有限公司
三氟乙酸 AR 江苏蓝色星球环保科技股份有限公司
中试王不留行提取物 — 自制
2.1.2 仪器
表 3 实验仪器
仪器 厂家
FA 2004电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司
DW调温电热器 上海平环燃烧设备工程技术有限公司
DHG电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司
EYELA旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司
SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司
TGL-16 C台式离心机 上海安亭科学仪器厂
KQ-250 E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司
721 N可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司
UV-2401紫外分光光度计 日本岛津
HH-2数显恒温水浴锅 金坛市科杰仪器厂
2.2 DNS法优化
2.2.1 DNS试剂的配置
TFA浓度对实验结果的影响，见表7。由表中数据可知，吸光度随TFA浓度的逐渐增加而呈现先增加后减小的趋势。实验表明TFA浓度为1.5 mol/L时水解效果较佳。
1 引言 1
1.1 多糖定义 1
1.2 多糖的化学结构 1
1.3 多糖的降解 1
1.4 多糖含量测定方法 1
1.5 本文研究的目的与意义 2
1.6 含量测定方法的确定 3
2 实验方法 3
2.1 试剂及仪器 3
2.2 DNS法优化 3
2.3 多糖水解方法优化 5
2.4 方法学考察 6
2.5 多糖含量测定 7
3 结果与分析 7
3.1 DNS法优化结果分析 7
3.2 葡萄糖标准曲线的制备 8
3.3 单因素实验结果分析 9
3.4 正交实验结果分析 10
3.5 方法学考察结果 11
3.6 多糖含量 11
结论 13
致谢 14
参考文献 15
1 引言
1.1 多糖定义
多糖（polysaccharides，PS）是由多个单糖通过糖苷键连接而成的高聚体，是四大生命基础物质之一[1]。
1.2 多糖的化学结构
多糖的结构单位是单糖，常见的单糖有：葡萄糖、果糖、核糖和鼠李糖等。而单糖之间以糖苷键相连接的，常见的有α-1,4-、β-1,4-、α, β-1,2-和α-1,6-糖苷键[2]。多糖水解生成单糖或者是寡糖（通过糖苷键将2-10个单糖连接而成小聚体）。
按多糖链有无分支，可将多糖分为直链多糖和支链多糖。直链多糖仅含一种糖苷键，如淀粉、糖原等；支链多糖含有多种糖苷键，如糖原、支链淀粉等。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
1.3 多糖的降解
多糖的定性、定量分析一般先将多糖降解成单糖或寡糖后再进行分析测定。常见的多糖降解方法（见表1）。
表 1 植物多糖降解方法的特点
水解方法 辅助试剂或仪器 优点 缺点
化学法 HCl、H2SO4、TFA 操作简单、反应快、水解产率高 均一性差、污染重等
物理法 微波、超声波、辐射 操作简单、可控性好、试剂使用少 收率低、成本高
生物法 生物酶 特异性、均一性好 酶价格昂贵、成本高
其中最常用方法为酸水解。利用中和、沉淀、透析等过程来消除酸的影响[3]。
1.4 多糖含量测定方法
1.4.1 苯酚-硫酸法
苯酚-硫酸法是一种常用的多糖测定方法。浓硫酸把多糖水解成单糖后并迅速脱水生成糠醛衍生物，该衍生物与苯酚作用显色，通过比色法来确定多糖含量。该法简便、快速、显色物稳定性好等优点[4]。但是有色物质会干扰多糖含量的测定。
1.4.2 蒽酮-硫酸法
多糖在经浓硫酸水解、脱水后与蒽醌形成有色物，通过测定吸光度来计算多糖含量。但是蒽酮-硫酸一般要求现配现用且避光，稳定性差。
1.4.3 3,5-二硝基水杨酸法
简称DNS法，在碱性加热的条件下，3,5-二硝基水杨酸被还原为氨基化合物，呈橘黄色，在一定的浓度范围，反应液颜色和还原糖含量之间会呈现一定的比例关系[5]。通过比色法测定样品中的含糖量。并通过公式（多糖=总糖-还原糖）来计算样品中多糖的量。此法简便、快速、适合大批量产品的检测。
1.4.4 液相色谱法
HPLC分析方法可对单糖、寡糖进行微量常量的分析。一般对糖的色谱分离时选择的流动相是乙腈和水，随着水的比例的减少糖的保留时间也随之减短[6]。而色谱柱一般采用的是氨基键合硅胶色谱柱。一般常用的检测器有示差折光检测器、蒸发光散射检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
1.4.5 薄层色谱法
简称TLC，根据吸附剂对样品组分的吸附能力的不同，以及展开剂对各组分解吸附能力的差异，使各组分从样品混合物中分离开来。TLC具有设备简单、操作简便、分离速度快等特点。李海棠等[7]采用此法测定了海康胶囊中海参多糖的含量。
1.4.6 其他方法
此外，滴定法（斐林氏滴定法、氧化还原法等）和气相色谱法也常用于糖类物质分析[8]。
化学方法测定的往往是总糖含量，但是由于操作简便、成本低等特点，仍被广泛应用。色谱法相对于化学法成本高但是灵敏度高、专属性强、准确度高。
1.5 本文研究目的与意义
王不留行是石竹科植物麦蓝菜（Vaccariasegetalis (Neck) Garcke）的干燥成熟种子，为中国药典收载药材[9]。
经研究发现王不留行提取物具有消肿敛疮，利水通淋等生物活性，所以在王不留行提取物生产加工的过程中，也常需要对提取物中的多糖进行监控和含量测定，因此选择合适的多糖分析方法十分重要。本论文就王不留行多糖的DNS含量测定方法进行研究，优化建立王不留行多糖的酸水解预处理方法和DNS含量测定方法，并进行方法学验证。
1.6 含量测定方法的确定
传统的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
多糖含量测定方法（苯酚-硫酸法等）测定步骤较繁琐，而且测定值为总糖的含量，不能消除样品中单糖的干扰，因此测得的多糖含量往往偏高。相比较而言，DNS法简便、快速、专属性强且能够消除总糖中单糖的干扰。本文研究的王不留行多糖为葡聚糖，标准品易得，因此本论文将采用DNS法进行测定多糖含量。
2 实验方法
2.1 试剂及仪器
2.1.1 试剂
表 2 实验试剂
试剂 等级 厂家
3,5-二硝基水杨酸 AR 国药集团化学试剂有限公司
四水合酒石酸钾钠 AR 江苏强盛功能化学股份有限公司
氢氧化钠 AR 上海久亿化学试剂有限公司
苯酚 AR 上海久亿化学试剂有限公司
无水亚硫酸钠 AR 上海久亿化学试剂有限公司
无水乙醇 AR 江苏强盛功能化学股份有限公司
三氟乙酸 AR 江苏蓝色星球环保科技股份有限公司
中试王不留行提取物 — 自制
2.1.2 仪器
表 3 实验仪器
仪器 厂家
FA 2004电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司
DW调温电热器 上海平环燃烧设备工程技术有限公司
DHG电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司
EYELA旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司
SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司
TGL-16 C台式离心机 上海安亭科学仪器厂
KQ-250 E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司
721 N可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司
UV-2401紫外分光光度计 日本岛津
HH-2数显恒温水浴锅 金坛市科杰仪器厂
2.2 DNS法优化
2.2.1 DNS试剂的配置
TFA浓度对实验结果的影响，见表7。由表中数据可知，吸光度随TFA浓度的逐渐增加而呈现先增加后减小的趋势。实验表明TFA浓度为1.5 mol/L时水解效果较佳。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/zygc/1521.html
