蝉花多糖的提取纯化工艺研究(附件)
目的探究蝉花多糖的最佳提取、纯化工艺参数。方法采用超声法辅助提取蝉花中的多糖，并采用单因素实验和正交实验优化其最佳提取工艺条件。采用分步醇沉法进行多糖的纯化。通过苯酚硫酸法检测多糖含量以算出提取率。结果超声提取蝉花多糖的最佳工艺参数为料液比1:30，在70℃下提取20 min，连续提3次。分步醇沉结果在60%乙醇浓度下多糖最多。结论超声提取降低了提取时间，提高了工作效率。分步醇沉表明蝉花多糖在40%乙醇浓度之后明显增高，在60%时所得的多糖粗提物的含量最高，为进一步研究蝉花多糖奠定了基础。关键词 超声波，蝉花多糖，提取，分步醇沉
目 录
1 引言 1
1.1 多糖提取工艺研究 1
1.2 多糖纯化工艺研究 2
2 课题研究目的及内容 3
2.1 课题研究目的 3
2.2 课题研究内容 3
3 材料与仪器 3
3.1 材料 3
3.2 仪器 4
4 实验方法 4
4.1 蝉花多糖的超声提取 4
4.2 蝉花多糖含量的测定 5
4.3 提取工艺优化 6
4.4 分步醇沉 7
4.5 红外光谱分析 8
5 结果与分析 8
5.1 葡萄糖标准曲线 8
5.2 稳定性实验 9
5.3 精密度实验 9
5.4 重复性实验 9
5.5 加样回收率 10
5.6 单因素结果与分析 10
5.7 正交实验结果 13
5.8 分步醇沉结果与分析 15
5.9 红外光谱分析 16
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
多糖是一类天然的化合物，其由各种糖链连接的单糖构成。其在生物体内广泛存在，具有复杂的生物学作用[1]。如今很多研究都证明多糖具有协助消化、抗疲劳[2]、抗衰老[3]、降血糖[4]及免疫调节等特殊的生物活性[5]，且无毒副作用，是生物体内除核酸和蛋白质外又一类重要的生 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
物分子。
在我国，对糖类的研究工作起步较晚。我国在多糖方面的研究开始于十几年代，全国第一次的糖生化学术会议后，《糖复合物的生化研究技术》出版，标志着我国在糖化学方面的研究工作已有了一个较好的开端[6]。近年来，多糖研究飞速发展，前景广阔，越来越多的成果在临床上得以应用，相信未来多糖的研究成果将走进千家万户。
1.1 多糖提取工艺研究
1.1.1 水提醇沉法
多糖溶于水而不溶于有机试剂，一般采用水为溶剂进行提取，乙醇来沉淀。方法是将原料磨碎倒入一定比例的水进行回流提取，提取液浓缩至一定体积后倒入无水乙醇将多糖分离出来。翟媛媛用此法提取紫花苜蓿多糖，料液比1∶10，温度95℃，60 min连续提取2次,多糖得率达3.71%[7]。
1.1.2 超声辅助提取法
此法使用超声波来辅助提取，因超声波有破壁作用，在空化作用的影响下使多糖溶出更多，缩短提取时间[8~9]。曹楠楠等用此法提取苦豆子多糖，响应面实验确定了料液比1∶50，温度50℃、提取时间30 min、超声功率280 W，在此条件下多糖提取率为8.51%[10]。
1.1.3 微波辅助提取法
此法使用微波提取，将蝉花与溶剂放入微波中，因为微波的存在，使细胞内温度和压力急剧上升，达到破壁的目的，使多糖溶出更多，时间也大大缩短[11]。姚婷等对湖州吴兴地区多糖进行研究，结果多糖最高得率为2.9644%[12]。
综上所述，提取方法中水提醇沉法多糖产量明显高于超声提取法及微波提取法，但是其耗费溶剂多，提取时间长，而微波提取成本较高且耗能高，超声相对耗能材少，且时间短，综合优于其他方法。
1.2 多糖纯化工艺研究
提取出粗多糖后，需要对其进行纯化操作，粗多糖首先是脱蛋白，一般采用Sevage法，然后脱色，一般采用大孔树脂脱色，接着是纯化，其实多糖的纯化是把含有各种多糖的粗多糖纯化为各种单一的多糖，以原理来说分离与纯化是很难区别开来的，因为有的时候在分离过程时已经在纯化了[13]。接下来介绍比较几种主流的纯化方法。
1.2.1 分级沉淀法
① 有机溶剂分离沉淀法
此法利用多糖的分子量不同来进行分离。因为在不同有机溶剂浓度下多糖的溶解度不同，可以利用这个原理调节浓度收集各浓度下的沉淀。因为蛋白质等杂质在低浓度下析出较多，使多糖含量下降，可采用高浓度的有机溶剂进行醇沉，或者采用分步醇沉的方式减少杂质的沉降，从而对多糖进行初步的提纯和分离[14]。耿安静等人采用此法对香菇精多糖醇沉，发现在30%醇浓度下多糖含量最多，到70%后几乎没有多糖析出，对香菇精多糖进行了初步的纯化[15]。此法简便易行，耗时较少。
② 盐析沉淀法
原理同1.2.1，利用不同浓度使多糖沉降。陈德玲等用此法萃取海参多糖最高回收率为96.3%[16]。此法成本低，但是容易产生共沉淀 ，而且此法纯化后还要进行透析去盐，增加了不稳定性。
③ 金属络合法
多糖分子能和金属离子形成络合物析出，因此也可用来纯化多糖[17]。秦蕾确定了沙棘叶多糖的最佳金属离子络合工艺，多糖与锌离子质量比5:1,锌离子的初始浓度6 mg/mL,络合8 h,此条件下的最佳络合率为73.89%[18]。此法需配制大量溶剂，耗时长，分离度好，但是多糖络合后还需解络合并洗去金属离子，难以保证金属离子的完全去除，对实验会有偏差。
④ 季铵盐沉淀法
季铵盐会与酸性和高分子多糖发生反应产生沉淀，此沉淀不溶于去离子水，由此可分离出多糖[19]。代巧玉的甘草多糖纯化中使用季铵盐络合不可避免的发生共沉淀，因此她将此法与乙醇沉淀法结合使用，效果显著[20]。何伟珍等人在银耳多糖的纯化中使用此法多糖含量高达76.28%[21]。此法的缺点是发生沉淀后很难保证多糖的纯度。
1.2.2 色谱分离法
① 离子交换柱层析
此法利用分子筛原理，又利用电荷性质不同和分子量不同的原理，使多糖达到分离效果[22]。陈莉等用此法纯化茯苓多糖，得到三种不同的多糖，分离效果显著[23]。周跃斌等用纤维素柱层析考察出水洗脱得率最高,为46.4%[24]。此法适合于分离各种酸性、中性及粘多糖。也可应用于不同中性多糖的分离。此法效果好，操作简便，但等待时间过长。
目 录
1 引言 1
1.1 多糖提取工艺研究 1
1.2 多糖纯化工艺研究 2
2 课题研究目的及内容 3
2.1 课题研究目的 3
2.2 课题研究内容 3
3 材料与仪器 3
3.1 材料 3
3.2 仪器 4
4 实验方法 4
4.1 蝉花多糖的超声提取 4
4.2 蝉花多糖含量的测定 5
4.3 提取工艺优化 6
4.4 分步醇沉 7
4.5 红外光谱分析 8
5 结果与分析 8
5.1 葡萄糖标准曲线 8
5.2 稳定性实验 9
5.3 精密度实验 9
5.4 重复性实验 9
5.5 加样回收率 10
5.6 单因素结果与分析 10
5.7 正交实验结果 13
5.8 分步醇沉结果与分析 15
5.9 红外光谱分析 16
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
多糖是一类天然的化合物，其由各种糖链连接的单糖构成。其在生物体内广泛存在，具有复杂的生物学作用[1]。如今很多研究都证明多糖具有协助消化、抗疲劳[2]、抗衰老[3]、降血糖[4]及免疫调节等特殊的生物活性[5]，且无毒副作用，是生物体内除核酸和蛋白质外又一类重要的生 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
物分子。
在我国，对糖类的研究工作起步较晚。我国在多糖方面的研究开始于十几年代，全国第一次的糖生化学术会议后，《糖复合物的生化研究技术》出版，标志着我国在糖化学方面的研究工作已有了一个较好的开端[6]。近年来，多糖研究飞速发展，前景广阔，越来越多的成果在临床上得以应用，相信未来多糖的研究成果将走进千家万户。
1.1 多糖提取工艺研究
1.1.1 水提醇沉法
多糖溶于水而不溶于有机试剂，一般采用水为溶剂进行提取，乙醇来沉淀。方法是将原料磨碎倒入一定比例的水进行回流提取，提取液浓缩至一定体积后倒入无水乙醇将多糖分离出来。翟媛媛用此法提取紫花苜蓿多糖，料液比1∶10，温度95℃，60 min连续提取2次,多糖得率达3.71%[7]。
1.1.2 超声辅助提取法
此法使用超声波来辅助提取，因超声波有破壁作用，在空化作用的影响下使多糖溶出更多，缩短提取时间[8~9]。曹楠楠等用此法提取苦豆子多糖，响应面实验确定了料液比1∶50，温度50℃、提取时间30 min、超声功率280 W，在此条件下多糖提取率为8.51%[10]。
1.1.3 微波辅助提取法
此法使用微波提取，将蝉花与溶剂放入微波中，因为微波的存在，使细胞内温度和压力急剧上升，达到破壁的目的，使多糖溶出更多，时间也大大缩短[11]。姚婷等对湖州吴兴地区多糖进行研究，结果多糖最高得率为2.9644%[12]。
综上所述，提取方法中水提醇沉法多糖产量明显高于超声提取法及微波提取法，但是其耗费溶剂多，提取时间长，而微波提取成本较高且耗能高，超声相对耗能材少，且时间短，综合优于其他方法。
1.2 多糖纯化工艺研究
提取出粗多糖后，需要对其进行纯化操作，粗多糖首先是脱蛋白，一般采用Sevage法，然后脱色，一般采用大孔树脂脱色，接着是纯化，其实多糖的纯化是把含有各种多糖的粗多糖纯化为各种单一的多糖，以原理来说分离与纯化是很难区别开来的，因为有的时候在分离过程时已经在纯化了[13]。接下来介绍比较几种主流的纯化方法。
1.2.1 分级沉淀法
① 有机溶剂分离沉淀法
此法利用多糖的分子量不同来进行分离。因为在不同有机溶剂浓度下多糖的溶解度不同，可以利用这个原理调节浓度收集各浓度下的沉淀。因为蛋白质等杂质在低浓度下析出较多，使多糖含量下降，可采用高浓度的有机溶剂进行醇沉，或者采用分步醇沉的方式减少杂质的沉降，从而对多糖进行初步的提纯和分离[14]。耿安静等人采用此法对香菇精多糖醇沉，发现在30%醇浓度下多糖含量最多，到70%后几乎没有多糖析出，对香菇精多糖进行了初步的纯化[15]。此法简便易行，耗时较少。
② 盐析沉淀法
原理同1.2.1，利用不同浓度使多糖沉降。陈德玲等用此法萃取海参多糖最高回收率为96.3%[16]。此法成本低，但是容易产生共沉淀 ，而且此法纯化后还要进行透析去盐，增加了不稳定性。
③ 金属络合法
多糖分子能和金属离子形成络合物析出，因此也可用来纯化多糖[17]。秦蕾确定了沙棘叶多糖的最佳金属离子络合工艺，多糖与锌离子质量比5:1,锌离子的初始浓度6 mg/mL,络合8 h,此条件下的最佳络合率为73.89%[18]。此法需配制大量溶剂，耗时长，分离度好，但是多糖络合后还需解络合并洗去金属离子，难以保证金属离子的完全去除，对实验会有偏差。
④ 季铵盐沉淀法
季铵盐会与酸性和高分子多糖发生反应产生沉淀，此沉淀不溶于去离子水，由此可分离出多糖[19]。代巧玉的甘草多糖纯化中使用季铵盐络合不可避免的发生共沉淀，因此她将此法与乙醇沉淀法结合使用，效果显著[20]。何伟珍等人在银耳多糖的纯化中使用此法多糖含量高达76.28%[21]。此法的缺点是发生沉淀后很难保证多糖的纯度。
1.2.2 色谱分离法
① 离子交换柱层析
此法利用分子筛原理，又利用电荷性质不同和分子量不同的原理，使多糖达到分离效果[22]。陈莉等用此法纯化茯苓多糖，得到三种不同的多糖，分离效果显著[23]。周跃斌等用纤维素柱层析考察出水洗脱得率最高,为46.4%[24]。此法适合于分离各种酸性、中性及粘多糖。也可应用于不同中性多糖的分离。此法效果好，操作简便，但等待时间过长。
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