杭白菊中绿原酸的含量测定
摘 要本文采用HPLC对杭白菊中绿原酸进行含量测定。采用的色谱条件为：CNW C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸（12: 88），流速1 mL·min-1，进样量10 μL，柱温25 ℃，检测波长340 nm。采用外标法进行计算。结果发现，绿原酸在0.2008-0.3012 μg范围内线性良好，R2 = 0.9999，平均加样回收率为100.1%，RSD为1.9%。本文所建立的方法操作简单、结果准确、可靠、重现性好，可用于杭白菊的质量控制。关健词：杭白菊；绿原酸；含量测定；HPLCAbstractIn this study, HPLC coupled with diode array detection was successfully developed to determine chlorogenic acid of Chrysanthemum morifolium. The chromatographic separations were carried out on a column of Diamonsil C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of a combination of A (acetonitrile) and B (0.1% formic acid in water) with the rat of 12: 88. The flow rate was 1.0 mL min-1, the sample injection volume was 10 μL and the column and sample temperature were at 25 ?C. The DAD was set at 340 nm for real-time monitoring of the peak intensity. It was found that the linear range of chlorogenic acid was in 0.2008-0.3012μg, R2 = 0.9999; the average recovery was 100.1%, RSD was 1.9%. The result showed that t
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me monitoring of the peak intensity. It was found that the linear range of chlorogenic acid was in 0.2008-0.3012μg, R2 = 0.9999; the average recovery was 100.1%, RSD was 1.9%. The result showed that the method established in this paper was simple, accurate, reliable, reproducible, and which can be used for quality control of Chrysanthemum morifolium.Keywords: Chrysanthemum morifolium; chlorogenic acid; determination; HPLC 1概述1.1 选题背景...........................................................................................................11.2不同品种菊花的概述 11.2.1 杭菊 11.2.2亳菊 21.2.3贡菊 31.2.4滁菊 31.2.5怀菊 31.3杭白菊的化学成分研究 41.3.1黄酮类成分 51.3.2挥发油类 51.3.3三萜及甾体类 61.3.4酚酸类 61.3.5微量元素 61.3.6其他 61.4杭白菊的药理活性研究 61.4.1心脑血管的保护作用 71.4.2降血压、降血糖及血脂的作用 71.4.3抗氧化作用 71.4.4抗癌作用 71.4.5神经保护作用 71.4.6肝脏的保护作用 81.4.7其他作用 82实验部分2.1材料 92.1.1实验仪器.........................................................................................................92.1.2试剂及药材 .92.2方法与结果 92.2.1色谱条件 92.2.2标准溶液的制备 102.2.3供试品溶液的制备 102.2.4线性关系考察 102.2.5精密度试验 112.2.6重复性试验 112.2.7稳定性试验 122.2.8加样回收率试验 122.2.9样品测定 122.3讨论 13结论 14参考文献 15致谢 191 概述1.1选题背景 杭白菊具有较高的药用价值，民间应用广泛，是卫生部首批准的药食同源的道地药材之一。杭白菊主要含有黄酮、挥发油、三萜、甾体、酚类、多糖及微量元素等多种成分[1-2]，具有心血管保护、降血脂、血糖、血压、抗氧化、抗癌、神经保护、肝保护等多种药理活性[3-7]。杭白菊传统的加工方法较多，主要有晒干法、蒸干法、阴干法、硫磺熏蒸法等，目前，市场上主要以热风干燥法和硫磺熏蒸法为其产地加工方法。绿原酸又名咖啡鞣酸,属酚类化合物,是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径形成的一种苯丙素类物质[8]。绿原酸具有抗菌、抗病毒、升高白细胞、止血、保肝利胆、促进胃肠蠕动、抗肿瘤、降压、清除自由基、兴奋中枢神经系统等多种生物活性。因此本文对杭白菊中的绿原酸进行含量测定，为杭白菊的质量控制提供理论依据。1.2不同品种菊花的概述 菊花为菊科植物菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序，始载于《神农本草经》，并被列为上品，又称为节华[9]其在我国有悠久的药用和栽培历史，其地理分布较为宽广，南起安徽歙县，北至河北安国，东起浙江桐乡,西至四川中江，南北纬度和东西经度跨度较大，再加上菊花生长的环境既有平原、丘陵又有山区，使菊花采收时间、加工季节的气温、湿度、光照等有很大的差别，这对菊花的产地加工方法和干燥造成不同程度的影响。加上各产地经过长期的栽培与实践经验，形成了各具特色的产地加工方法，这也为道地菊花药材的形成起到了一定积极的作用。不同品种菊花如图1.1所示。1.2.1 杭菊杭菊地处杭嘉湖平原，其收获季节湿度偏大，但是阳光较为充足。《增订伪药条辩》[10]：“黄菊产杭州海宁等处，有蒸晒两种，蒸菊，将鲜菊入蒸笼内蒸瘪再晒、烘焙至燥，其色老黄，收藏朵瓣不散。晒菊，以鲜花烈日晒干，其花嫩黄，朵松花花瓣易散。”早期的杭黄菊加工方法除蒸法外，还采用鲜花直接晒干的方法，但由于鲜花直接晒干，可导致菊花散瓣，颜色较暗，加之速度过慢已被淘汰。因此杭菊较为传统的产地加工方法是“先蒸后晒”的方法，即将鲜花放在特制的蒸笼内蒸，将菊花做成“菊花饼”然后取出放在通风处进行晾晒，蒸法可以快速的杀死菊花中的酶，这样可以防止菊花中的多酚类成分被氧化分解，从而使加工后的菊花保持较好的花色及品质。“蒸晒”这种传统的加工方法也先后被改进为烘房干燥法和现在比较流行的热风干燥法。烘房干燥法，即采用炭火的热气将鲜花烘干，但是这种方法对农户个体来说成本较大，而且与现代较为先进的热风干燥法相比产量及效率均较低，已逐渐被淘汰。近几年新发展起来的热风干燥法是先采用蒸汽将新鲜菊花蒸汽杀青，然后采用热风将其烘干。一般一个生产流程后将菊花取出放在阴凉处晾干，之后再进行同样的2-3个生产流程，以确保干燥的菊花在后期的存储中不会返潮。这种热风干燥法生产量大，相比多家烘房干燥，其成本较低，节省劳动力，加工的菊花品质较好，其在杭菊产区已逐渐成为广泛应用的趋势。由于浙江地区与江苏地区的土壤、气候差别较大，浙江、江苏两地杭白菊的质量也有较大的差别。相比之下，江苏杭白菊的质量较差，加工后的菊花花瓣易掉落，因此在早期的江苏地区，通常在蒸菊花的过程中加入适量的淀粉以防止花瓣的脱落。之后，在江苏的射阳、盐城等地，逐渐采用硫磺熏蒸的方法来加工杭白菊。硫磺熏的目的与蒸汽杀青的作用有异曲同工之效，主要起到了快速杀酶，排出花中的水分，便于干燥，同时也具漂白、防虫及防霉变、延长药材保质期等作用，加之近年来各种以菊花为原料的保健茶饮品的开发与上市，使菊花原料需求量猛增，使其迅速的在杭白菊产区被广泛的采用。然而，硫磺熏蒸后可以使药材中的化学成分发生改变[11-13] ；同时由于，用于熏蒸的硫熏均为天然硫磺，其含有砷、铅等重金属，硫熏后可以使砷、铅等重金属残留量增大[14-16]。在2008年，曾曝光“菊花之乡”江苏射阳大批硫熏“毒菊花”流入市场，这严重的危害的公众的身体健康。1.2.2亳菊 亳菊所处纬度偏北，菊花采收于秋末季节，湿度小，空气干燥。早期的产地加工为阴干法，即将采下来的整株菊花倒挂于室内通风处，待阴干后摘下花朵。用此方法加工的菊花花瓣伸展，呈褶扇形，花色类白，但易散瓣掉瓣，但其挥发油的含量保存较好，主要作为药用，质量上乘。但是，由于此方法需要较长的时间和较为宽阔的场地，因此，在后期的应用中被逐渐淘汰。 在亳菊产区，硫磺熏蒸法与杭菊产区有一定的区别。杭菊产区是先将杭菊的头状花序采下来，蒸成菊花饼，之后再进行硫磺熏蒸12-18 h左右，之后将其置于太阳下晒干。而亳菊产区是直接将整株菊花砍下来，倒挂或者松散堆放，待花瓣上的露水挥干后再用硫磺进行熏蒸，一般熏蒸在夜间进行，熏蒸12-18 h左右，之后将亳菊摊开、晾晒，晒干后将亳菊的头状花序剪下来，即可。因此，杭菊和亳菊除了花的外观性状不同外，成品的另一个差别是，亳菊干燥花往往带有较长的菊花柄。1.2.3贡菊贡菊的产区在山区，地理位置处于安徽最南部，因为山高雾多，贡菊的收获季节湿度大，自然晒干较为困难，然而，此地木炭资源较为丰富，因此贡菊的传统加工主要采用炭火烘干的方法。此法干燥速度较快，能保持花色不变，加工的品质较好。由于贡菊不管是花色、还是口味均较好，使其作为菊花茶的需求量不断的增大，而传统的加工方法产量较小，此方法也逐渐被热风干燥这种方法所代替。但贡菊和杭菊产区的热风干燥方法有所区别，即,杭菊产区是先将菊花用蒸汽杀青之后再用热风将其烘干；而贡菊产区是直接将鲜菊花置于烘房中，用炭火进行烘干，用这种加工方法加工的贡菊成品外观性状较好。1.2.4滁菊《增订伪药条辩》[17]载：“白滁菊出安徽滁州者，其采法先后剪枝连花带叶倒挂檐下，阴干后再摘花，故气味更足。”可见早期滁菊采用阴干的方法。滁菊的产区处于江淮丘陵地区，纬度居中，经度较为偏东，滁菊收获季节空气湿度较大，因此，早期此地区主要利用硫磺熏蒸的方法，以确保菊花的品质不受蛀虫的影响。但随着现在滁菊种植的产业化发展，多数的滁菊是商家进行基地种植或从农户家里收购来后进行大规模的生产，目前主要也以热风干燥为主，传统的阴干、硫磺熏蒸的方法已被淘汰。1.2.5怀菊怀菊的产地纬度偏北，菊花采收期的气温、湿度等与亳菊相似，因此早期的怀菊产地加工方法与亳菊相似，即，待大部分菊花盛开后将整株割下，倒挂或堆放于通风处阴干，或用硫磺熏后晾干，之后再将头状花序摘下。目前怀菊主要采用的是蒸汽低温烘干法，一般6-9 h即可烘干。其是受“蔬菜的脱水保存”思路的启发，采用40-50℃的低温将怀菊花烘干，虽然烘干后的菊花成品外观颜色没有杭菊的颜色鲜亮，但其作为茶叶泡于水中的颜色，极为鲜亮，花型完整，而且口感也较好，具有“怀泌”之美誉。图1.1 不同品种的菊花1.3杭白菊的化学成分研究 杭白菊为菊科植物菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序，为常用中药，具有疏风清热、平肝明目、清热解毒之功效。菊花始载于《神农本草经》[18]，由于其生长的地理位置变迁、加工方法的不断改进，逐渐形成了不同的商品，如：杭白菊、滁菊、贡菊、亳菊、怀菊、济菊等[19-20]。杭白菊含有多种类型的化学成分，主要含有黄酮类，酚酸类，挥发油类，三萜类化合物，氨基酸类等化学成分。不同品种菊花化学成分有一定的差异。1.3.1黄酮类成分 据统计目前杭白菊中黄酮类化合物有47个化合物，主要分为三种结构类型，即，黄酮类、二氢黄酮类和黄酮醇类；主要有香叶木素，香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷，香叶木素-7-O-β-D-(6′′-O-p-羟基苯乙酰)-葡萄糖苷，芹菜素，芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，芹菜素-7-O-β-D-芸香糖苷，金合欢素，金合欢素-7-O-β-D-半乳糖苷，金合欢素-7-O-β-D-芸香糖苷，金合欢素-7-O-β-D-(6′′-O-乙酰基)-葡萄糖苷，5,3′,4′-三羟基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，木樨草素，木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，木樨草素-7-O-β-D-(6′′-O-乙酰基)-葡萄糖苷，木樨草素-7-O-β-D-(6′′-O-丙二酸单酰)-葡萄糖苷，槲皮素，槲皮素-7-O-β-D-半乳糖苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，异鼠李素，异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷等[21-22 ]。主要的结构如图1.2。 图1.2 杭白菊中主要黄酮类成分的结构1.3.2挥发油类 杭白菊含有丰富的挥发油类成分，主要为单萜,倍半萜及其含氧衍生物，如α-姜黄烯，β-马榄烯，石竹烯，龙脑，香木兰烯，樟脑等[23-24]。1.3.3三萜及甾体类 三萜及甾体类化合物有6 个，分别为：棕榈酸-16-β-羟基假蒲公英甾醇酯，棕榈酸 16β, 28-二羟基羽扇醇酯，假蒲公英甾醇，棕榈酸-16β, 22α-二羟基假蒲公英甾醇酯，β-谷甾醇，蒲公英甾醇[25]其结构式见图1.3。图1.3 杭白菊中三萜及甾体类化合物的结构1.3.4酚酸类化合物 酚酸类化合物广泛存在于杭白菊中，其主要为苯丙酸类化学成分[26]，如：绿原酸、咖啡酸、咖啡酰奎尼酸、二咖啡酰奎尼酸、阿魏酸等，主要的化学结构如图1.4。图 1.4 杭白菊中酚类化合物的结构1.3.5微量元素 通过采用ICPOES和ICP-MS等方法对杭白菊中的微量元素进行分析，发现杭白菊中富含Mg、Fe、Ca、Zn、Mn、Cu、Mg等多种微量元素。1.3.6其他 杭白菊中除了含有以上化合物外，还含有氨基酸、脂肪酸、多糖等化学成分。1.4杭白菊的药理活性研究 据报道，杭白菊具有抗氧化作用、心血管保护作用、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌等较广泛的药理作用[27-28]。 1.4.1心脑血管的保护作用 经实验研究，杭白菊提取物具有明显的舒血管作用，其作用机制可能与NO 的介导、钙离子通道阻滞等有关，同时，呈浓度相关性[29-32]。也有发现其提取物具有降低大鼠心室易颤性，能抑制心率失常；能明显抑制氯仿及乌头碱等诱发的大鼠心率失常[33]。同时也发现，杭白菊提取物具有正性肌力作用[34-35] ，这种作用可能与其所含的酚酸类化合物有关。1.4.2降血压、降血糖及血脂的作用杭白菊的醇提物能显著的抑制高膳食大鼠体内的三酰甘油和血胆固醇，可以明显的改善血清中胆固醇含量过高，这对预防和治疗高血压及高血脂等相关疾病具有显著的实际意义[36]。杭白菊作为药用、茶用可均降血压可能与杭白菊所含的总黄酮有关[37]。杭白菊具有降低血糖的功效，目前市场上流行的许多降糖药都含有杭白菊，如“降糖康”，这些药物均能降低糖尿病患者血液中的血糖、糖化蛋白含量等，能明显的降低血液的粘稠度，这些作用可能与微量元素Cr、黄酮类、奎宁酸类成分有关[38]。1.4.3抗氧化作用 杭白菊具有明显的抗氧化活性[39]，其作用机制可能与黄酮类和酚酸类成分有关。目前有研究发现，杭白菊的醇提物比水提物的抗氧化活性要好。实验发现，杭白菊的醇提物能降低实验动物血清中的超氧化歧化酶、丙二醛等的含量，同时能提高平滑肌细胞的数目，这些作用呈浓度相关性[40]。1.4.4抗癌作用 实验发现杭白菊所含的木樨草素能抑制肠癌细胞的增殖其毒性[41]。除了黄酮类成分具有抗癌作用外，挥发油类成分也具有较好抗癌活性，如，β-榄香烯。目前市场上流行的抗癌新药-“榄香烯乳注射液”，就是以β-榄香烯为其主要的活性成分之一[23]。1.4.5神经保护作用杭白菊具有明显的神经保护作用[42-43]。研究发现，其可以显著的抑制多种细胞毒性基因的表达，抵抗多种细胞毒性，从而明显的改善细胞的活性，这些作用的发挥可能与其所含的黄酮类成分（芹菜素、木犀草素等）和酚酸类成分（奎宁酸类）有关，杭白菊可作为开发神经系统防治的潜在新药。1.4.6肝脏的保护作用 通过不同的实验研究，发现杭白菊能抑制实验小鼠的转氨酶，提高肝脏及组织中的SOD活性、降低自由基的数量，这些作用可能与杭白菊所含的多糖类成分有关[44]。同时杭白菊能显著的抑制致癌基因的表达。这些作用均表明，杭白菊具有一定的肝保护作用。1.4.7其他作用 除了以上主要药理作用外，杭白菊还具有抗菌、抗病毒的作用。实验发现杭白菊能对抗多种细菌，如：金黄色葡萄球菌、变形杆菌等[45]。也有研究发现杭白菊中的金合欢苷能抵抗HIV等病毒的侵害，这可以将其作为抗艾滋病的潜在新药。通过大量实验研究证明，杭白菊的多种药理作用的发挥与其所含多种化学成分有着密切的关系。2 实验部分2.1材料2.1.1实验仪器 Waters e 2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站（Waters公司）；CNW C18 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；DJ-02型中药粉碎机（上海淀久机械制造公司）；KQ5200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。2.1.2试剂及药材绿原酸（购于中国食品药品监督管理局，批号分别为：110753-201313）；乙腈（Fisher)；娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。杭白菊2015年购于陕西康盛堂药业有限公司，经陕西国际商贸学院雷国莲教授鉴定为菊科植物菊花Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥花蕾。2.2方法与结果2.2.1色谱条件 CNW C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸（12: 88），流速1 mL·min-1；进样量10 μL；柱温25 ℃；检测波长340 nm，结果见图2.1，图2.2。图2.1 杭白菊样品HPLC色谱图图2.2绿原酸对照品HPLC色谱图2.2.2标准品溶液的制备精密称取绿原酸标准品，用甲醇溶解并定容，制成含标准品0.1004 mg·mL-1的标准溶液，置4 ℃备用。2.2.3供试品溶液的制备精密称取杭白菊粉末0.500 g，加入20 mL 60%甲醇，精密称定，超声处理0.5 h，放置室温后，补足减失重量，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液，置4℃备用。2.2.4线性关系考察分别吸取绿原酸标准品溶液2、2.5、5、7.5、10、15、20 μL分别注入高效液相色谱仪中，按照2.2.1项下的色谱条件进行试验，测定峰面积，以标准品的体积（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，y=23954x-640.03，R2=0.9999。结果表明：在0.2008-0.3012 μg范围内，绿原酸的峰面积Y与进样量（μg）X的线性关系较好。结果见表2.1，图2.3。表2.1 线性关系考察进样量（μL）22.557.5101520峰面积4797659970120152175310239880357820479560图2.3 绿原酸标准曲线2.2.5精密度试验精密吸取10 μL绿原酸标准品溶液，连续进样6次，测定其峰面积，结果表明，本方法精密度良好。RSD为0.01%（n=6）。结果见表2.2。表 2.2 精密度试验实验编号123456RSD（%）峰面积2398892398802397702398672398402398920.012.2.6重复性试验 分别精密称取杭白菊样品适量，平行6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下的色谱条件进行实验测定峰面积，计算绿原酸的含量，结果绿原酸平均含量为3.87 mg·-1g，RSD为0.12%。结果见表2.3。表2.3 重复性实验结果实验编号123456RSD（%）峰面积2114321153211282120121134211430.122.2.7稳定性试验精密称取，杭白菊样品适量按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h内重复进样6次，按照2.2.1项下的色谱条件进行，测定峰面积，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。RSD为0.15%。结果见表2.4。表2.4 稳定性实验结果测定时间（h）02481224RSD（%）峰面积2112821213211562113221129211750.152.2.8加样回收率试验 精密称取杭白菊样品适量，分别加入绿原酸标准品，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下的色谱条件进行试验，测定峰面积，计算回收率。结果平均回收率为100.1%，RSD为1.9%，结果见表2.5。表2.5 加样回收率实验结果（n=6）编号样品含量mg对照品加入量/mg实测值回收率/%平均回收率RSD/%10.3280.3260.654100.0100.11.920.3320.3260.65799.830.3290.3260.64697.340.3340.3260.670103.250.3210.3260.64599.360.3270.3260.657101.22.2.9样品测定 按上述含量测定方法测定3批样品中绿原酸的含量，结果见表2.6。表2.6 杭白菊样品含量测定结果（n=3）批号绿原酸含量（mg·g-1）15013.63515024.19315033.783AVERAGE3.8702.3 讨论 在绿原酸测定中，本实验采用甲醇和乙醇的不同比例溶液对杭白菊中的绿原酸进行提取，结果发现含60%的甲醇溶液的提取率较高；对提取方法进行比较发现，超声提取法的提取率较高，而回流提取法提取率较低，这可能与绿原酸热稳定性较差有关，回流提取温度过高会造成绿原酸的损失，因此本文采用60%甲醇，超声提取30min作为杭白菊中的绿原酸的提取方法。 参考文献资料，对杭白菊中的绿原酸的含量测定方法进行比较，发现HPLC法较为简单、快速、准确。同时对色谱条件进行比较筛选。分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸进行比较，发现以乙腈-0.1%甲酸为洗脱溶剂，所得色谱图较好，峰的分离度较高；因此，最终确定以乙腈-0.1%甲酸（12: 88）为本实验的流动相。结 论杭白菊是我国传统的中药材，含多种药物活性成分，具有较高的药食两用价值。现代药理研究发现杭白菊中所含的绿原酸具有较好的药理活性。因此本文对杭白菊中的绿原酸进行含量测定。通过对杭白菊中绿原酸的含量测定方法的建立，方法学的研究及样品的测定，表明本文所建立绿原酸的HPLC检测方法简单易行、精密度、重复性、稳定性均较好，可作为杭白菊中绿原酸的质量控制方法，为市场上菊花的质量控制提供理论依据。参考文献[1] 张璐, 季巧遇, 周冬生, 等. 杭白菊的现代研究进展[J]. 江西中医药, 2011, 42 (10): 60-62.[2] 沈伟桥, 孙海燕, 等. 杭白菊生物活性成分及药理研究进展[J]. 茶叶, 2006, 32 (3): 141-144.[3] 顾瑶华, 秦民坚. 我国药用菊花的化学及药理学研究进展[J]. 中国野生植物资源, 2004, 23 (6). 16-21[4] Duh, P D, Tu, Y Y, Yen, G C. 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me monitoring of the peak intensity. It was found that the linear range of chlorogenic acid was in 0.2008-0.3012μg, R2 = 0.9999; the average recovery was 100.1%, RSD was 1.9%. The result showed that the method established in this paper was simple, accurate, reliable, reproducible, and which can be used for quality control of Chrysanthemum morifolium.Keywords: Chrysanthemum morifolium; chlorogenic acid; determination; HPLC 1概述1.1 选题背景...........................................................................................................11.2不同品种菊花的概述 11.2.1 杭菊 11.2.2亳菊 21.2.3贡菊 31.2.4滁菊 31.2.5怀菊 31.3杭白菊的化学成分研究 41.3.1黄酮类成分 51.3.2挥发油类 51.3.3三萜及甾体类 61.3.4酚酸类 61.3.5微量元素 61.3.6其他 61.4杭白菊的药理活性研究 61.4.1心脑血管的保护作用 71.4.2降血压、降血糖及血脂的作用 71.4.3抗氧化作用 71.4.4抗癌作用 71.4.5神经保护作用 71.4.6肝脏的保护作用 81.4.7其他作用 82实验部分2.1材料 92.1.1实验仪器.........................................................................................................92.1.2试剂及药材 .92.2方法与结果 92.2.1色谱条件 92.2.2标准溶液的制备 102.2.3供试品溶液的制备 102.2.4线性关系考察 102.2.5精密度试验 112.2.6重复性试验 112.2.7稳定性试验 122.2.8加样回收率试验 122.2.9样品测定 122.3讨论 13结论 14参考文献 15致谢 191 概述1.1选题背景 杭白菊具有较高的药用价值，民间应用广泛，是卫生部首批准的药食同源的道地药材之一。杭白菊主要含有黄酮、挥发油、三萜、甾体、酚类、多糖及微量元素等多种成分[1-2]，具有心血管保护、降血脂、血糖、血压、抗氧化、抗癌、神经保护、肝保护等多种药理活性[3-7]。杭白菊传统的加工方法较多，主要有晒干法、蒸干法、阴干法、硫磺熏蒸法等，目前，市场上主要以热风干燥法和硫磺熏蒸法为其产地加工方法。绿原酸又名咖啡鞣酸,属酚类化合物,是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径形成的一种苯丙素类物质[8]。绿原酸具有抗菌、抗病毒、升高白细胞、止血、保肝利胆、促进胃肠蠕动、抗肿瘤、降压、清除自由基、兴奋中枢神经系统等多种生物活性。因此本文对杭白菊中的绿原酸进行含量测定，为杭白菊的质量控制提供理论依据。1.2不同品种菊花的概述 菊花为菊科植物菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序，始载于《神农本草经》，并被列为上品，又称为节华[9]其在我国有悠久的药用和栽培历史，其地理分布较为宽广，南起安徽歙县，北至河北安国，东起浙江桐乡,西至四川中江，南北纬度和东西经度跨度较大，再加上菊花生长的环境既有平原、丘陵又有山区，使菊花采收时间、加工季节的气温、湿度、光照等有很大的差别，这对菊花的产地加工方法和干燥造成不同程度的影响。加上各产地经过长期的栽培与实践经验，形成了各具特色的产地加工方法，这也为道地菊花药材的形成起到了一定积极的作用。不同品种菊花如图1.1所示。1.2.1 杭菊杭菊地处杭嘉湖平原，其收获季节湿度偏大，但是阳光较为充足。《增订伪药条辩》[10]：“黄菊产杭州海宁等处，有蒸晒两种，蒸菊，将鲜菊入蒸笼内蒸瘪再晒、烘焙至燥，其色老黄，收藏朵瓣不散。晒菊，以鲜花烈日晒干，其花嫩黄，朵松花花瓣易散。”早期的杭黄菊加工方法除蒸法外，还采用鲜花直接晒干的方法，但由于鲜花直接晒干，可导致菊花散瓣，颜色较暗，加之速度过慢已被淘汰。因此杭菊较为传统的产地加工方法是“先蒸后晒”的方法，即将鲜花放在特制的蒸笼内蒸，将菊花做成“菊花饼”然后取出放在通风处进行晾晒，蒸法可以快速的杀死菊花中的酶，这样可以防止菊花中的多酚类成分被氧化分解，从而使加工后的菊花保持较好的花色及品质。“蒸晒”这种传统的加工方法也先后被改进为烘房干燥法和现在比较流行的热风干燥法。烘房干燥法，即采用炭火的热气将鲜花烘干，但是这种方法对农户个体来说成本较大，而且与现代较为先进的热风干燥法相比产量及效率均较低，已逐渐被淘汰。近几年新发展起来的热风干燥法是先采用蒸汽将新鲜菊花蒸汽杀青，然后采用热风将其烘干。一般一个生产流程后将菊花取出放在阴凉处晾干，之后再进行同样的2-3个生产流程，以确保干燥的菊花在后期的存储中不会返潮。这种热风干燥法生产量大，相比多家烘房干燥，其成本较低，节省劳动力，加工的菊花品质较好，其在杭菊产区已逐渐成为广泛应用的趋势。由于浙江地区与江苏地区的土壤、气候差别较大，浙江、江苏两地杭白菊的质量也有较大的差别。相比之下，江苏杭白菊的质量较差，加工后的菊花花瓣易掉落，因此在早期的江苏地区，通常在蒸菊花的过程中加入适量的淀粉以防止花瓣的脱落。之后，在江苏的射阳、盐城等地，逐渐采用硫磺熏蒸的方法来加工杭白菊。硫磺熏的目的与蒸汽杀青的作用有异曲同工之效，主要起到了快速杀酶，排出花中的水分，便于干燥，同时也具漂白、防虫及防霉变、延长药材保质期等作用，加之近年来各种以菊花为原料的保健茶饮品的开发与上市，使菊花原料需求量猛增，使其迅速的在杭白菊产区被广泛的采用。然而，硫磺熏蒸后可以使药材中的化学成分发生改变[11-13] ；同时由于，用于熏蒸的硫熏均为天然硫磺，其含有砷、铅等重金属，硫熏后可以使砷、铅等重金属残留量增大[14-16]。在2008年，曾曝光“菊花之乡”江苏射阳大批硫熏“毒菊花”流入市场，这严重的危害的公众的身体健康。1.2.2亳菊 亳菊所处纬度偏北，菊花采收于秋末季节，湿度小，空气干燥。早期的产地加工为阴干法，即将采下来的整株菊花倒挂于室内通风处，待阴干后摘下花朵。用此方法加工的菊花花瓣伸展，呈褶扇形，花色类白，但易散瓣掉瓣，但其挥发油的含量保存较好，主要作为药用，质量上乘。但是，由于此方法需要较长的时间和较为宽阔的场地，因此，在后期的应用中被逐渐淘汰。 在亳菊产区，硫磺熏蒸法与杭菊产区有一定的区别。杭菊产区是先将杭菊的头状花序采下来，蒸成菊花饼，之后再进行硫磺熏蒸12-18 h左右，之后将其置于太阳下晒干。而亳菊产区是直接将整株菊花砍下来，倒挂或者松散堆放，待花瓣上的露水挥干后再用硫磺进行熏蒸，一般熏蒸在夜间进行，熏蒸12-18 h左右，之后将亳菊摊开、晾晒，晒干后将亳菊的头状花序剪下来，即可。因此，杭菊和亳菊除了花的外观性状不同外，成品的另一个差别是，亳菊干燥花往往带有较长的菊花柄。1.2.3贡菊贡菊的产区在山区，地理位置处于安徽最南部，因为山高雾多，贡菊的收获季节湿度大，自然晒干较为困难，然而，此地木炭资源较为丰富，因此贡菊的传统加工主要采用炭火烘干的方法。此法干燥速度较快，能保持花色不变，加工的品质较好。由于贡菊不管是花色、还是口味均较好，使其作为菊花茶的需求量不断的增大，而传统的加工方法产量较小，此方法也逐渐被热风干燥这种方法所代替。但贡菊和杭菊产区的热风干燥方法有所区别，即,杭菊产区是先将菊花用蒸汽杀青之后再用热风将其烘干；而贡菊产区是直接将鲜菊花置于烘房中，用炭火进行烘干，用这种加工方法加工的贡菊成品外观性状较好。1.2.4滁菊《增订伪药条辩》[17]载：“白滁菊出安徽滁州者，其采法先后剪枝连花带叶倒挂檐下，阴干后再摘花，故气味更足。”可见早期滁菊采用阴干的方法。滁菊的产区处于江淮丘陵地区，纬度居中，经度较为偏东，滁菊收获季节空气湿度较大，因此，早期此地区主要利用硫磺熏蒸的方法，以确保菊花的品质不受蛀虫的影响。但随着现在滁菊种植的产业化发展，多数的滁菊是商家进行基地种植或从农户家里收购来后进行大规模的生产，目前主要也以热风干燥为主，传统的阴干、硫磺熏蒸的方法已被淘汰。1.2.5怀菊怀菊的产地纬度偏北，菊花采收期的气温、湿度等与亳菊相似，因此早期的怀菊产地加工方法与亳菊相似，即，待大部分菊花盛开后将整株割下，倒挂或堆放于通风处阴干，或用硫磺熏后晾干，之后再将头状花序摘下。目前怀菊主要采用的是蒸汽低温烘干法，一般6-9 h即可烘干。其是受“蔬菜的脱水保存”思路的启发，采用40-50℃的低温将怀菊花烘干，虽然烘干后的菊花成品外观颜色没有杭菊的颜色鲜亮，但其作为茶叶泡于水中的颜色，极为鲜亮，花型完整，而且口感也较好，具有“怀泌”之美誉。图1.1 不同品种的菊花1.3杭白菊的化学成分研究 杭白菊为菊科植物菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序，为常用中药，具有疏风清热、平肝明目、清热解毒之功效。菊花始载于《神农本草经》[18]，由于其生长的地理位置变迁、加工方法的不断改进，逐渐形成了不同的商品，如：杭白菊、滁菊、贡菊、亳菊、怀菊、济菊等[19-20]。杭白菊含有多种类型的化学成分，主要含有黄酮类，酚酸类，挥发油类，三萜类化合物，氨基酸类等化学成分。不同品种菊花化学成分有一定的差异。1.3.1黄酮类成分 据统计目前杭白菊中黄酮类化合物有47个化合物，主要分为三种结构类型，即，黄酮类、二氢黄酮类和黄酮醇类；主要有香叶木素，香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷，香叶木素-7-O-β-D-(6′′-O-p-羟基苯乙酰)-葡萄糖苷，芹菜素，芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，芹菜素-7-O-β-D-芸香糖苷，金合欢素，金合欢素-7-O-β-D-半乳糖苷，金合欢素-7-O-β-D-芸香糖苷，金合欢素-7-O-β-D-(6′′-O-乙酰基)-葡萄糖苷，5,3′,4′-三羟基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，木樨草素，木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，木樨草素-7-O-β-D-(6′′-O-乙酰基)-葡萄糖苷，木樨草素-7-O-β-D-(6′′-O-丙二酸单酰)-葡萄糖苷，槲皮素，槲皮素-7-O-β-D-半乳糖苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，异鼠李素，异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷等[21-22 ]。主要的结构如图1.2。 图1.2 杭白菊中主要黄酮类成分的结构1.3.2挥发油类 杭白菊含有丰富的挥发油类成分，主要为单萜,倍半萜及其含氧衍生物，如α-姜黄烯，β-马榄烯，石竹烯，龙脑，香木兰烯，樟脑等[23-24]。1.3.3三萜及甾体类 三萜及甾体类化合物有6 个，分别为：棕榈酸-16-β-羟基假蒲公英甾醇酯，棕榈酸 16β, 28-二羟基羽扇醇酯，假蒲公英甾醇，棕榈酸-16β, 22α-二羟基假蒲公英甾醇酯，β-谷甾醇，蒲公英甾醇[25]其结构式见图1.3。图1.3 杭白菊中三萜及甾体类化合物的结构1.3.4酚酸类化合物 酚酸类化合物广泛存在于杭白菊中，其主要为苯丙酸类化学成分[26]，如：绿原酸、咖啡酸、咖啡酰奎尼酸、二咖啡酰奎尼酸、阿魏酸等，主要的化学结构如图1.4。图 1.4 杭白菊中酚类化合物的结构1.3.5微量元素 通过采用ICPOES和ICP-MS等方法对杭白菊中的微量元素进行分析，发现杭白菊中富含Mg、Fe、Ca、Zn、Mn、Cu、Mg等多种微量元素。1.3.6其他 杭白菊中除了含有以上化合物外，还含有氨基酸、脂肪酸、多糖等化学成分。1.4杭白菊的药理活性研究 据报道，杭白菊具有抗氧化作用、心血管保护作用、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌等较广泛的药理作用[27-28]。 1.4.1心脑血管的保护作用 经实验研究，杭白菊提取物具有明显的舒血管作用，其作用机制可能与NO 的介导、钙离子通道阻滞等有关，同时，呈浓度相关性[29-32]。也有发现其提取物具有降低大鼠心室易颤性，能抑制心率失常；能明显抑制氯仿及乌头碱等诱发的大鼠心率失常[33]。同时也发现，杭白菊提取物具有正性肌力作用[34-35] ，这种作用可能与其所含的酚酸类化合物有关。1.4.2降血压、降血糖及血脂的作用杭白菊的醇提物能显著的抑制高膳食大鼠体内的三酰甘油和血胆固醇，可以明显的改善血清中胆固醇含量过高，这对预防和治疗高血压及高血脂等相关疾病具有显著的实际意义[36]。杭白菊作为药用、茶用可均降血压可能与杭白菊所含的总黄酮有关[37]。杭白菊具有降低血糖的功效，目前市场上流行的许多降糖药都含有杭白菊，如“降糖康”，这些药物均能降低糖尿病患者血液中的血糖、糖化蛋白含量等，能明显的降低血液的粘稠度，这些作用可能与微量元素Cr、黄酮类、奎宁酸类成分有关[38]。1.4.3抗氧化作用 杭白菊具有明显的抗氧化活性[39]，其作用机制可能与黄酮类和酚酸类成分有关。目前有研究发现，杭白菊的醇提物比水提物的抗氧化活性要好。实验发现，杭白菊的醇提物能降低实验动物血清中的超氧化歧化酶、丙二醛等的含量，同时能提高平滑肌细胞的数目，这些作用呈浓度相关性[40]。1.4.4抗癌作用 实验发现杭白菊所含的木樨草素能抑制肠癌细胞的增殖其毒性[41]。除了黄酮类成分具有抗癌作用外，挥发油类成分也具有较好抗癌活性，如，β-榄香烯。目前市场上流行的抗癌新药-“榄香烯乳注射液”，就是以β-榄香烯为其主要的活性成分之一[23]。1.4.5神经保护作用杭白菊具有明显的神经保护作用[42-43]。研究发现，其可以显著的抑制多种细胞毒性基因的表达，抵抗多种细胞毒性，从而明显的改善细胞的活性，这些作用的发挥可能与其所含的黄酮类成分（芹菜素、木犀草素等）和酚酸类成分（奎宁酸类）有关，杭白菊可作为开发神经系统防治的潜在新药。1.4.6肝脏的保护作用 通过不同的实验研究，发现杭白菊能抑制实验小鼠的转氨酶，提高肝脏及组织中的SOD活性、降低自由基的数量，这些作用可能与杭白菊所含的多糖类成分有关[44]。同时杭白菊能显著的抑制致癌基因的表达。这些作用均表明，杭白菊具有一定的肝保护作用。1.4.7其他作用 除了以上主要药理作用外，杭白菊还具有抗菌、抗病毒的作用。实验发现杭白菊能对抗多种细菌，如：金黄色葡萄球菌、变形杆菌等[45]。也有研究发现杭白菊中的金合欢苷能抵抗HIV等病毒的侵害，这可以将其作为抗艾滋病的潜在新药。通过大量实验研究证明，杭白菊的多种药理作用的发挥与其所含多种化学成分有着密切的关系。2 实验部分2.1材料2.1.1实验仪器 Waters e 2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站（Waters公司）；CNW C18 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；DJ-02型中药粉碎机（上海淀久机械制造公司）；KQ5200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。2.1.2试剂及药材绿原酸（购于中国食品药品监督管理局，批号分别为：110753-201313）；乙腈（Fisher)；娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。杭白菊2015年购于陕西康盛堂药业有限公司，经陕西国际商贸学院雷国莲教授鉴定为菊科植物菊花Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥花蕾。2.2方法与结果2.2.1色谱条件 CNW C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸（12: 88），流速1 mL·min-1；进样量10 μL；柱温25 ℃；检测波长340 nm，结果见图2.1，图2.2。图2.1 杭白菊样品HPLC色谱图图2.2绿原酸对照品HPLC色谱图2.2.2标准品溶液的制备精密称取绿原酸标准品，用甲醇溶解并定容，制成含标准品0.1004 mg·mL-1的标准溶液，置4 ℃备用。2.2.3供试品溶液的制备精密称取杭白菊粉末0.500 g，加入20 mL 60%甲醇，精密称定，超声处理0.5 h，放置室温后，补足减失重量，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液，置4℃备用。2.2.4线性关系考察分别吸取绿原酸标准品溶液2、2.5、5、7.5、10、15、20 μL分别注入高效液相色谱仪中，按照2.2.1项下的色谱条件进行试验，测定峰面积，以标准品的体积（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，y=23954x-640.03，R2=0.9999。结果表明：在0.2008-0.3012 μg范围内，绿原酸的峰面积Y与进样量（μg）X的线性关系较好。结果见表2.1，图2.3。表2.1 线性关系考察进样量（μL）22.557.5101520峰面积4797659970120152175310239880357820479560图2.3 绿原酸标准曲线2.2.5精密度试验精密吸取10 μL绿原酸标准品溶液，连续进样6次，测定其峰面积，结果表明，本方法精密度良好。RSD为0.01%（n=6）。结果见表2.2。表 2.2 精密度试验实验编号123456RSD（%）峰面积2398892398802397702398672398402398920.012.2.6重复性试验 分别精密称取杭白菊样品适量，平行6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下的色谱条件进行实验测定峰面积，计算绿原酸的含量，结果绿原酸平均含量为3.87 mg·-1g，RSD为0.12%。结果见表2.3。表2.3 重复性实验结果实验编号123456RSD（%）峰面积2114321153211282120121134211430.122.2.7稳定性试验精密称取，杭白菊样品适量按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h内重复进样6次，按照2.2.1项下的色谱条件进行，测定峰面积，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。RSD为0.15%。结果见表2.4。表2.4 稳定性实验结果测定时间（h）02481224RSD（%）峰面积2112821213211562113221129211750.152.2.8加样回收率试验 精密称取杭白菊样品适量，分别加入绿原酸标准品，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下的色谱条件进行试验，测定峰面积，计算回收率。结果平均回收率为100.1%，RSD为1.9%，结果见表2.5。表2.5 加样回收率实验结果（n=6）编号样品含量mg对照品加入量/mg实测值回收率/%平均回收率RSD/%10.3280.3260.654100.0100.11.920.3320.3260.65799.830.3290.3260.64697.340.3340.3260.670103.250.3210.3260.64599.360.3270.3260.657101.22.2.9样品测定 按上述含量测定方法测定3批样品中绿原酸的含量，结果见表2.6。表2.6 杭白菊样品含量测定结果（n=3）批号绿原酸含量（mg·g-1）15013.63515024.19315033.783AVERAGE3.8702.3 讨论 在绿原酸测定中，本实验采用甲醇和乙醇的不同比例溶液对杭白菊中的绿原酸进行提取，结果发现含60%的甲醇溶液的提取率较高；对提取方法进行比较发现，超声提取法的提取率较高，而回流提取法提取率较低，这可能与绿原酸热稳定性较差有关，回流提取温度过高会造成绿原酸的损失，因此本文采用60%甲醇，超声提取30min作为杭白菊中的绿原酸的提取方法。 参考文献资料，对杭白菊中的绿原酸的含量测定方法进行比较，发现HPLC法较为简单、快速、准确。同时对色谱条件进行比较筛选。分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸进行比较，发现以乙腈-0.1%甲酸为洗脱溶剂，所得色谱图较好，峰的分离度较高；因此，最终确定以乙腈-0.1%甲酸（12: 88）为本实验的流动相。结 论杭白菊是我国传统的中药材，含多种药物活性成分，具有较高的药食两用价值。现代药理研究发现杭白菊中所含的绿原酸具有较好的药理活性。因此本文对杭白菊中的绿原酸进行含量测定。通过对杭白菊中绿原酸的含量测定方法的建立，方法学的研究及样品的测定，表明本文所建立绿原酸的HPLC检测方法简单易行、精密度、重复性、稳定性均较好，可作为杭白菊中绿原酸的质量控制方法，为市场上菊花的质量控制提供理论依据。参考文献[1] 张璐, 季巧遇, 周冬生, 等. 杭白菊的现代研究进展[J]. 江西中医药, 2011, 42 (10): 60-62.[2] 沈伟桥, 孙海燕, 等. 杭白菊生物活性成分及药理研究进展[J]. 茶叶, 2006, 32 (3): 141-144.[3] 顾瑶华, 秦民坚. 我国药用菊花的化学及药理学研究进展[J]. 中国野生植物资源, 2004, 23 (6). 16-21[4] Duh, P D, Tu, Y Y, Yen, G C. 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