毛细管电泳分离纯化大豆多肽研究
摘 要本文以高效毛细管电泳为研究工具，成功分离并检测出了大豆蛋白水解产物的多肽分子量。同时探讨了运行缓冲溶液pH、表面活性剂浓度、运行电压这三个因素对多肽分离测定效果的影响。实验结果表明毛细管电泳分离检测大豆多肽的最优化工艺条件为运行缓冲溶液pH为8.5、表面活性剂浓度为3.5 mmol/L、运行电压为17kV。在最佳实验条件下，经高效毛细管电泳对大豆蛋白水解物进行分离及纯化后发现，水解物为分子量普遍低于6214Da的小分子肽，证明了高效毛细管电泳法是分离纯化大豆多肽行之有效的实验方法。
Key words: Soy protein; Polypeptide; Enzymatic hydrolysis; High performance capillary electrophoresis 目 录
1 绪论 1
1.1大豆多肽的研究 1
1.1.1基本概念 1
1.1.2多肽的生产 1
1.1.3大豆多肽的生理功能 2
1.1.4大豆多肽的分离纯化技术 3
1.2 国内外研究进展 4
1.2.1国外进展 4
1.2.2国内进展 4
1.3毛细管电泳分离 5
1.3.1毛细管电泳分离的研究进展 5
1.3.2毛细管电泳分离在多肽分析中的应用 6
1.4研究目的及意义 6
2 实验部分 7
2.1实验材料与仪器 7
2.1.1材料及试剂 7
2.1.2设备及仪器 7
2.2 实验步骤 7
2.2.1大豆多肽的制备 7
2.2.2 样品溶液的预处理 8
2.2.3毛细管电泳法操作流程 8
3 结果与讨论 11
3.1反应机理 11
3.1.1微波作用机理 11
3.1.2复合酶的作用机理 11
3.2电泳条件的优化 11
3.2.1运行缓冲溶液pH的影响 11
3.2.2表面活性剂浓度的影响 12
3.2.3运行电压的影响 13
3.3多肽分子量的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
确定 13
4 结论 17
参考文献 19
致谢 21
1 绪论
1.1大豆多肽的研究
1.1.1基本概念
自古以来，我国便是农业大国，盛产的粮食种类繁多，大豆就包含其中。大豆因富含蛋白营养素及其他多种生理活性物质，一直深受我国人民的喜爱，所以蛋白质加工生产的历史源远流长。二十种氨基酸构成了所有生物蛋白质的基础组分，肽键将这些氨基酸彼此相连从而形成“肽”物质。
大豆多肽可借助现代生物科技作为技术途径实现从大豆球蛋白到小分子肽的转化。事实上，大豆多肽并非是一种单一的纯物质，其组分可分为低肽分子、少量游离氨基酸、无机盐和糖。其氨基酸组成通常不超过十个，多肽链的长度均值约为3.3，大部分多肽的分子量都不超过1000Da，并且基础组分之一的游离氨基酸占比低于七分之一。现已确认大豆蛋白质的氨基酸结构与大豆多肽其实并无区别，二者之间的最大差别就在于肽链长度的不同。相比较而言，大豆多肽含有的必需氨基酸的组成比例更加合理且峰度更大，所以大豆多肽的营养价值远高于同类物质如大豆蛋白质、氨基酸等[1,2]。
1.1.2多肽的生产
传统的蛋白质水解产物的制备方式丰富多彩，常见的有生物法、化学法及合成法。
化学法，顾名思义指的是利用化学物质如氢氧化钠、盐酸等来水解蛋白，但该法通常反应较为剧烈，导致氨基酸原有的形态被破坏，甚至会有毒副产物生成，该法正处于被淘汰的边缘。目前已经涌现出不少更可取的生产方式，以酶解法为代表的新兴生产方式，正因为反应过程温和、反应速率快、无消旋作用等副作用产生、保持产物原有的氨基酸结构、多肽产品纯度高等优点，逐渐成为主流生产方式[3,4]。
多肽的生物制法对反应底物的选择较为挑剔，通常原材料来自乳清蛋白、大豆蛋白及酪蛋白，底物的选择一般出于对原材料营养价值、抗原性、功能性和口感等多因素的综合考量。
酶解法是为了提高底物利用率、升级产品性能而诞生的升级生产方式，可采用的酶的种类有外肽酶和内肽酶两种。外肽酶常用于有针对性的水解疏水性氨基酸，有助于提升多肽产品的甜味及口感的改善；内肽酶通过水解游离氨基酸使其在多肽产品中的含量降低从而有利于多肽产物的提纯。实际生产应用中，为了实现对底物最大化的利用，常采用外肽酶结合内肽酶共同作用的生产方式。
1.1.3大豆多肽的生理功能
大豆多肽可从多方面调节机体的生理代谢过程，比如降血压、抑制胆固醇、高营养且易于吸收、提升骨密度、强化肌肉运动力等功效，是药学、食品学的一个具有广阔前景的研究热点课题[5]。
（1）降血压、抑制胆固醇
有研究证实，患有遗传性高血压的病人将大豆多肽作为主要食物来源后，血管内皮细胞激肽酶II的正常活动被大豆多肽抑制，说明大豆多肽可以发挥降低血压水平的功效；并且大豆多肽还能增进生物体甲状腺激素的分泌，调节胆汁酸的正常代谢，同时促使机体加速排出胆固醇，有效实现控制并降低血液中胆固醇浓度的目的[6]。大豆多肽抑制胆固醇的作用机制可能在于它能干扰机体肠道对食物中胆固醇的二次吸收，促进肠胃蠕动从而加速胆固醇的排出。
（2）易消化吸收
相关学者对人体的生理代谢过程进行研究后发现，含有蛋白质的食物摄入人体内后，在消化管酶的水解作用下，人体吸收的最终形式不一定是游离氨基酸形式，身体能吸收和利用的更多的是低肽形式。换句话说，相比较氨基酸而言，肽类物质能更轻易且高效地被人体吸收、转化及利用。同时，对于那些有蛋白质过敏史或因缺乏相关酶系统而无法吸收分解蛋白质的特殊人群，分子量处于400及以下范围的大豆多肽因不会引发过敏反应及其特有的低抗原型成为这类人群的蛋白质重要营养素来源。
Key words: Soy protein; Polypeptide; Enzymatic hydrolysis; High performance capillary electrophoresis 目 录
1 绪论 1
1.1大豆多肽的研究 1
1.1.1基本概念 1
1.1.2多肽的生产 1
1.1.3大豆多肽的生理功能 2
1.1.4大豆多肽的分离纯化技术 3
1.2 国内外研究进展 4
1.2.1国外进展 4
1.2.2国内进展 4
1.3毛细管电泳分离 5
1.3.1毛细管电泳分离的研究进展 5
1.3.2毛细管电泳分离在多肽分析中的应用 6
1.4研究目的及意义 6
2 实验部分 7
2.1实验材料与仪器 7
2.1.1材料及试剂 7
2.1.2设备及仪器 7
2.2 实验步骤 7
2.2.1大豆多肽的制备 7
2.2.2 样品溶液的预处理 8
2.2.3毛细管电泳法操作流程 8
3 结果与讨论 11
3.1反应机理 11
3.1.1微波作用机理 11
3.1.2复合酶的作用机理 11
3.2电泳条件的优化 11
3.2.1运行缓冲溶液pH的影响 11
3.2.2表面活性剂浓度的影响 12
3.2.3运行电压的影响 13
3.3多肽分子量的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
确定 13
4 结论 17
参考文献 19
致谢 21
1 绪论
1.1大豆多肽的研究
1.1.1基本概念
自古以来，我国便是农业大国，盛产的粮食种类繁多，大豆就包含其中。大豆因富含蛋白营养素及其他多种生理活性物质，一直深受我国人民的喜爱，所以蛋白质加工生产的历史源远流长。二十种氨基酸构成了所有生物蛋白质的基础组分，肽键将这些氨基酸彼此相连从而形成“肽”物质。
大豆多肽可借助现代生物科技作为技术途径实现从大豆球蛋白到小分子肽的转化。事实上，大豆多肽并非是一种单一的纯物质，其组分可分为低肽分子、少量游离氨基酸、无机盐和糖。其氨基酸组成通常不超过十个，多肽链的长度均值约为3.3，大部分多肽的分子量都不超过1000Da，并且基础组分之一的游离氨基酸占比低于七分之一。现已确认大豆蛋白质的氨基酸结构与大豆多肽其实并无区别，二者之间的最大差别就在于肽链长度的不同。相比较而言，大豆多肽含有的必需氨基酸的组成比例更加合理且峰度更大，所以大豆多肽的营养价值远高于同类物质如大豆蛋白质、氨基酸等[1,2]。
1.1.2多肽的生产
传统的蛋白质水解产物的制备方式丰富多彩，常见的有生物法、化学法及合成法。
化学法，顾名思义指的是利用化学物质如氢氧化钠、盐酸等来水解蛋白，但该法通常反应较为剧烈，导致氨基酸原有的形态被破坏，甚至会有毒副产物生成，该法正处于被淘汰的边缘。目前已经涌现出不少更可取的生产方式，以酶解法为代表的新兴生产方式，正因为反应过程温和、反应速率快、无消旋作用等副作用产生、保持产物原有的氨基酸结构、多肽产品纯度高等优点，逐渐成为主流生产方式[3,4]。
多肽的生物制法对反应底物的选择较为挑剔，通常原材料来自乳清蛋白、大豆蛋白及酪蛋白，底物的选择一般出于对原材料营养价值、抗原性、功能性和口感等多因素的综合考量。
酶解法是为了提高底物利用率、升级产品性能而诞生的升级生产方式，可采用的酶的种类有外肽酶和内肽酶两种。外肽酶常用于有针对性的水解疏水性氨基酸，有助于提升多肽产品的甜味及口感的改善；内肽酶通过水解游离氨基酸使其在多肽产品中的含量降低从而有利于多肽产物的提纯。实际生产应用中，为了实现对底物最大化的利用，常采用外肽酶结合内肽酶共同作用的生产方式。
1.1.3大豆多肽的生理功能
大豆多肽可从多方面调节机体的生理代谢过程，比如降血压、抑制胆固醇、高营养且易于吸收、提升骨密度、强化肌肉运动力等功效，是药学、食品学的一个具有广阔前景的研究热点课题[5]。
（1）降血压、抑制胆固醇
有研究证实，患有遗传性高血压的病人将大豆多肽作为主要食物来源后，血管内皮细胞激肽酶II的正常活动被大豆多肽抑制，说明大豆多肽可以发挥降低血压水平的功效；并且大豆多肽还能增进生物体甲状腺激素的分泌，调节胆汁酸的正常代谢，同时促使机体加速排出胆固醇，有效实现控制并降低血液中胆固醇浓度的目的[6]。大豆多肽抑制胆固醇的作用机制可能在于它能干扰机体肠道对食物中胆固醇的二次吸收，促进肠胃蠕动从而加速胆固醇的排出。
（2）易消化吸收
相关学者对人体的生理代谢过程进行研究后发现，含有蛋白质的食物摄入人体内后，在消化管酶的水解作用下，人体吸收的最终形式不一定是游离氨基酸形式，身体能吸收和利用的更多的是低肽形式。换句话说，相比较氨基酸而言，肽类物质能更轻易且高效地被人体吸收、转化及利用。同时，对于那些有蛋白质过敏史或因缺乏相关酶系统而无法吸收分解蛋白质的特殊人群，分子量处于400及以下范围的大豆多肽因不会引发过敏反应及其特有的低抗原型成为这类人群的蛋白质重要营养素来源。
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