德里腐霉菌胞外多糖的提取、分离纯化及结构初步鉴定研究
目 录
1 引言 1
1.1 微生物培养方法 1
1.2 微生物多糖提取方法 2
1.3 微生物多糖除蛋白质的方法 2
1.4 多种多糖的进一步分离 3
1.5 结构的初步鉴定 3
1.6 课题研究的内容及目的 4
2 实验部分 4
2.1 实验材料 4
2.2 德里腐霉菌种培养 5
2.3 德里腐霉胞外多糖的提取 6
2.4 德里腐霉胞外多糖的分离纯化 7
2.5 德里腐霉胞外多糖初步结构鉴定 8
3 结果与分析 11
3.1 菌种的培育结果 11
3.2 优化多糖提取工艺实验结果与分析 11
3.3 紫外全波长扫描结果与分析 13
3.4 多糖含量测定结果及分析 14
3.5 红外光谱结果与分析 16
3.6 分子量的测定结果与分析 17
3.7 抗氧化测定结果与分析 18
结论 20
致谢 21
参考文献 22
1 引言
徳里腐霉菌(Pythium deliense Meurs)，菌丝大都基内生，不规则分枝，是烟草茎烧病的病原之一，喜于温暖地区，主要分布在马来西亚，中国，印度等。它容易引起植物幼苗碎倒病,根腐病和瓜果腐烂病，如黄瓜，会使黄瓜发病后12小时根呈浅黄色水渍状，24小时后根颜色加深，茎基水渍状倒伏。徳里腐霉菌属于真菌，菌落在CMA上呈放射状，其胞外多糖属于真菌多糖。真菌多糖是一种特殊的生物活性物质如灵芝多糖，银耳多糖，虫草多糖等都是一种生物反应增强剂和调 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
节剂，具有免疫调节功能，抗肿瘤作用，抗病毒作用，抗氧化作用[1]。真菌多糖存在广泛，培养容易，不易受外界条件的影响，无污染，产量高。以徳里腐霉菌为研究对象，对其胞外分泌的多糖进行提取，分离纯化及初步结构鉴定研究，为从源头根治德里腐霉对农作物的危害如幼苗猝倒病,根腐病和瓜果腐烂病作基础并以期发现徳里腐霉菌的药理作用的潜力，为进一步的药理活性研究奠定基础，更好的造福人类[2]。
1.1 微生物培养方法
培养细菌真菌的一般4个步骤[3]：①配制含有营养物质的培养基；②将配制好的培养基高温灭菌：可以将培养皿上、培养基内混有的细菌或真菌的孢子等杀死；③冷却；④接种：将少量细菌或真菌放在培养基上的过程叫接种；⑤恒温培养：把接种后的培养皿放在保持恒定温度的培养箱中进行培养。
培养基是人工按一定比例配置的微生物生长[4]，繁殖，代谢所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可以分为碳源，氮源，生长因素，无机盐和水。根据微生物的不同，培养基的配制方法也不同。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离纯化方法有单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法。平板划线法步骤：倒平板-标记培养基名称-划线。稀释涂布平板法步骤：倒平板-制备稀释液-涂布-培养-挑菌落[5]。
微生物个体微小，代谢旺盛，生长繁殖快，如果保存不妥，容易被杂菌污染，甚至会使细菌死亡。因此保存好菌种是十分必要和重要的。常用的菌种保存方法：传代培养法，载体法，悬液法，冷冻法和真空干燥法。根据微生物和实验条件选择适宜的方法。
1.2 微生物多糖提取方法
1.2.1 化学提取法
化学提取法利用添加的化学物质破坏多糖和细胞间的结合力，可加速多糖溶出。常见得化学提取方法有CER，EDTA，戊二醛和碱，HCHO/NaOH。CER法总粗糖提取率比碱液提取法低3倍左右，但碱液提取会造成随着pH增加，糖蛋白中的二硫键断裂，糖醛酸会水解等，从而导致产物的污染[6]。即使EDTA法有较高的提取量，较低的细胞裂解程度，多糖提取物仍会被残余的EDTA污染[7]（尽管透析法可以将部分EDTA消除)。HCHO/NaOH方法里的HCHO会影响多糖的性质，从而对碳水化合物结果的判定产生影响。
1.2.1 物理提取方法
一般的物理提取方法：超声波处理法，离心法，微波处理及加热等。这些方法基本都是通过外力促使多糖从细胞中分离出来，溶解在溶液中从而达到分离多糖的目的。物理提取法效率一般比化学提取法效率低得多，但是物理提取法与化学提取法相比还是存在些优点，它不会引入其他化学成分，只是使多糖分子断裂，改变了多糖分子量大小，并使分子量的分布发生变化，有利于对多糖成分和结构的分析。
1.3 微生物多糖除蛋白质的方法
提取的多糖无论是来自植物、动物，还是来自微生物产的胞外多糖，其中一般都混杂着蛋白质。有很多方法除去这些蛋白质，包括三氯乙酸（TCA）、Sevag法、酶法或Sevag法+酶解。
植物多糖一般用TCA法除蛋白。 三氯乙酸法即向多糖溶液中滴加三氯乙酸至溶液，出现浑浊为止就不再继续滴加三氯乙酸，然后离心除去沉淀得无蛋白多糖溶液[8]。如果采用此法，则需要选择合适的三氯乙酸用量。因为三氯乙酸的浓度与蛋白的去 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
除率和多糖的损失率有关。
动物和微生物胞外多糖则采用Sevag法、酶法或Sevag法+酶解相结合的方法。Sevag法是其中最经典的一种方法，加入多糖水溶液体积约1/5的氯仿和氯仿体积1/5的正丁醇，剧烈摇晃使蛋白质变性，然后离心去除沉淀[9]。采用Sevag法，多糖不易降解，但蛋白质除去效率不高。因为蛋白除去率不高，常需要反复几次，从而样品损失较大。
1.4 多种多糖的进一步分离
经过除蛋白的多糖粗提物成分复杂是含多种多糖的混合物，要得到单一的多糖组分,还需要进一步分离。分级分步沉淀法、季铵盐络合物法、超滤法、柱层析法等都是一般的分离多种多糖的方法。各种溶解度相差较大的多糖虽然适用分级分步沉淀法，但是其乙醇消耗量高与沉淀时因挥发损耗大[10],不是一种占优势的分离方法[11]。季铵盐络合物法的原理是不同多糖的阴离子电荷密度不同，与季铵盐生成沉淀的能力不同，因而能将含有多种多糖的粗多糖纯化[12][13]。超滤法是一种分子分离的膜分离法。它具有操作条件温和，不用添加化学试剂，不破坏热敏物质的优点[14][15]。
柱层析包含离子交换层析和凝胶柱层析。离子交换柱层析的原理是因为各种被分离物质的带电粒子电性不同[16]。被分离物质的带电粒子与离子交换剂上的反离子进行交换，通过改变洗脱溶剂的pH值，将混合物中的多种组分依次逐个洗脱下来。DEAE-纤维素是使用最多的一种离子交换层析，它不仅能使多糖脱色，还可以分离多糖。凝胶柱层析的介质是多孔性网状结构的物质，具有分子筛效应，不适合分离粘多糖。当分子量不同的粗多糖经这一介质时，各组分根据分子量的不同被分离[17]。一般有凝胶有葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。
1.5 结构的初步鉴定
由于真菌多糖具有多方面的生物活性，所以已成为一个研制热点。目前许多食用真菌多糖产品已投放市场，以真菌多糖作为功能添加剂的保健食品也相继出现，并且多种真菌多糖已被制成药品。但是对于未开发的真菌多糖如徳里腐霉菌来说，还需要进一步加强研究和开发的深度。分光光度分析是根据物质的吸收光谱研究物质的成分，结构[18]及物质间相互作用的手段。每种物质都有其特有的，固定的吸收光谱曲线，可以根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低来判断或测定该物质的含量。傅里叶红外变换光谱仪可以用于化学组分的分析和分子立体构型的判断。高校液相色谱仪主要用于分离生物，医学相关的生物大分子，天然化合物，以及用气相色谱难以分离的不易挥发和热稳定性差的化合物。此方法已经成为农学，工学，商检和法检领域的重要分离分析技术[19]。进一步通过紫外，红外，高效液相了解德里腐霉菌的含糖量，分子量[20]，及其结构和抗氧化活性[21]。
1 引言 1
1.1 微生物培养方法 1
1.2 微生物多糖提取方法 2
1.3 微生物多糖除蛋白质的方法 2
1.4 多种多糖的进一步分离 3
1.5 结构的初步鉴定 3
1.6 课题研究的内容及目的 4
2 实验部分 4
2.1 实验材料 4
2.2 德里腐霉菌种培养 5
2.3 德里腐霉胞外多糖的提取 6
2.4 德里腐霉胞外多糖的分离纯化 7
2.5 德里腐霉胞外多糖初步结构鉴定 8
3 结果与分析 11
3.1 菌种的培育结果 11
3.2 优化多糖提取工艺实验结果与分析 11
3.3 紫外全波长扫描结果与分析 13
3.4 多糖含量测定结果及分析 14
3.5 红外光谱结果与分析 16
3.6 分子量的测定结果与分析 17
3.7 抗氧化测定结果与分析 18
结论 20
致谢 21
参考文献 22
1 引言
徳里腐霉菌(Pythium deliense Meurs)，菌丝大都基内生，不规则分枝，是烟草茎烧病的病原之一，喜于温暖地区，主要分布在马来西亚，中国，印度等。它容易引起植物幼苗碎倒病,根腐病和瓜果腐烂病，如黄瓜，会使黄瓜发病后12小时根呈浅黄色水渍状，24小时后根颜色加深，茎基水渍状倒伏。徳里腐霉菌属于真菌，菌落在CMA上呈放射状，其胞外多糖属于真菌多糖。真菌多糖是一种特殊的生物活性物质如灵芝多糖，银耳多糖，虫草多糖等都是一种生物反应增强剂和调 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
节剂，具有免疫调节功能，抗肿瘤作用，抗病毒作用，抗氧化作用[1]。真菌多糖存在广泛，培养容易，不易受外界条件的影响，无污染，产量高。以徳里腐霉菌为研究对象，对其胞外分泌的多糖进行提取，分离纯化及初步结构鉴定研究，为从源头根治德里腐霉对农作物的危害如幼苗猝倒病,根腐病和瓜果腐烂病作基础并以期发现徳里腐霉菌的药理作用的潜力，为进一步的药理活性研究奠定基础，更好的造福人类[2]。
1.1 微生物培养方法
培养细菌真菌的一般4个步骤[3]：①配制含有营养物质的培养基；②将配制好的培养基高温灭菌：可以将培养皿上、培养基内混有的细菌或真菌的孢子等杀死；③冷却；④接种：将少量细菌或真菌放在培养基上的过程叫接种；⑤恒温培养：把接种后的培养皿放在保持恒定温度的培养箱中进行培养。
培养基是人工按一定比例配置的微生物生长[4]，繁殖，代谢所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可以分为碳源，氮源，生长因素，无机盐和水。根据微生物的不同，培养基的配制方法也不同。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离纯化方法有单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法。平板划线法步骤：倒平板-标记培养基名称-划线。稀释涂布平板法步骤：倒平板-制备稀释液-涂布-培养-挑菌落[5]。
微生物个体微小，代谢旺盛，生长繁殖快，如果保存不妥，容易被杂菌污染，甚至会使细菌死亡。因此保存好菌种是十分必要和重要的。常用的菌种保存方法：传代培养法，载体法，悬液法，冷冻法和真空干燥法。根据微生物和实验条件选择适宜的方法。
1.2 微生物多糖提取方法
1.2.1 化学提取法
化学提取法利用添加的化学物质破坏多糖和细胞间的结合力，可加速多糖溶出。常见得化学提取方法有CER，EDTA，戊二醛和碱，HCHO/NaOH。CER法总粗糖提取率比碱液提取法低3倍左右，但碱液提取会造成随着pH增加，糖蛋白中的二硫键断裂，糖醛酸会水解等，从而导致产物的污染[6]。即使EDTA法有较高的提取量，较低的细胞裂解程度，多糖提取物仍会被残余的EDTA污染[7]（尽管透析法可以将部分EDTA消除)。HCHO/NaOH方法里的HCHO会影响多糖的性质，从而对碳水化合物结果的判定产生影响。
1.2.1 物理提取方法
一般的物理提取方法：超声波处理法，离心法，微波处理及加热等。这些方法基本都是通过外力促使多糖从细胞中分离出来，溶解在溶液中从而达到分离多糖的目的。物理提取法效率一般比化学提取法效率低得多，但是物理提取法与化学提取法相比还是存在些优点，它不会引入其他化学成分，只是使多糖分子断裂，改变了多糖分子量大小，并使分子量的分布发生变化，有利于对多糖成分和结构的分析。
1.3 微生物多糖除蛋白质的方法
提取的多糖无论是来自植物、动物，还是来自微生物产的胞外多糖，其中一般都混杂着蛋白质。有很多方法除去这些蛋白质，包括三氯乙酸（TCA）、Sevag法、酶法或Sevag法+酶解。
植物多糖一般用TCA法除蛋白。 三氯乙酸法即向多糖溶液中滴加三氯乙酸至溶液，出现浑浊为止就不再继续滴加三氯乙酸，然后离心除去沉淀得无蛋白多糖溶液[8]。如果采用此法，则需要选择合适的三氯乙酸用量。因为三氯乙酸的浓度与蛋白的去 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
除率和多糖的损失率有关。
动物和微生物胞外多糖则采用Sevag法、酶法或Sevag法+酶解相结合的方法。Sevag法是其中最经典的一种方法，加入多糖水溶液体积约1/5的氯仿和氯仿体积1/5的正丁醇，剧烈摇晃使蛋白质变性，然后离心去除沉淀[9]。采用Sevag法，多糖不易降解，但蛋白质除去效率不高。因为蛋白除去率不高，常需要反复几次，从而样品损失较大。
1.4 多种多糖的进一步分离
经过除蛋白的多糖粗提物成分复杂是含多种多糖的混合物，要得到单一的多糖组分,还需要进一步分离。分级分步沉淀法、季铵盐络合物法、超滤法、柱层析法等都是一般的分离多种多糖的方法。各种溶解度相差较大的多糖虽然适用分级分步沉淀法，但是其乙醇消耗量高与沉淀时因挥发损耗大[10],不是一种占优势的分离方法[11]。季铵盐络合物法的原理是不同多糖的阴离子电荷密度不同，与季铵盐生成沉淀的能力不同，因而能将含有多种多糖的粗多糖纯化[12][13]。超滤法是一种分子分离的膜分离法。它具有操作条件温和，不用添加化学试剂，不破坏热敏物质的优点[14][15]。
柱层析包含离子交换层析和凝胶柱层析。离子交换柱层析的原理是因为各种被分离物质的带电粒子电性不同[16]。被分离物质的带电粒子与离子交换剂上的反离子进行交换，通过改变洗脱溶剂的pH值，将混合物中的多种组分依次逐个洗脱下来。DEAE-纤维素是使用最多的一种离子交换层析，它不仅能使多糖脱色，还可以分离多糖。凝胶柱层析的介质是多孔性网状结构的物质，具有分子筛效应，不适合分离粘多糖。当分子量不同的粗多糖经这一介质时，各组分根据分子量的不同被分离[17]。一般有凝胶有葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。
1.5 结构的初步鉴定
由于真菌多糖具有多方面的生物活性，所以已成为一个研制热点。目前许多食用真菌多糖产品已投放市场，以真菌多糖作为功能添加剂的保健食品也相继出现，并且多种真菌多糖已被制成药品。但是对于未开发的真菌多糖如徳里腐霉菌来说，还需要进一步加强研究和开发的深度。分光光度分析是根据物质的吸收光谱研究物质的成分，结构[18]及物质间相互作用的手段。每种物质都有其特有的，固定的吸收光谱曲线，可以根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低来判断或测定该物质的含量。傅里叶红外变换光谱仪可以用于化学组分的分析和分子立体构型的判断。高校液相色谱仪主要用于分离生物，医学相关的生物大分子，天然化合物，以及用气相色谱难以分离的不易挥发和热稳定性差的化合物。此方法已经成为农学，工学，商检和法检领域的重要分离分析技术[19]。进一步通过紫外，红外，高效液相了解德里腐霉菌的含糖量，分子量[20]，及其结构和抗氧化活性[21]。
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