细菌素分离纯化及应用研究
目 录
1 引言 1
1.1 乳酸菌细菌素概述 2
1.2 乳酸菌细菌素分离纯化方法 3
1.3 乳酸菌细菌素的应用进展 5
1.4 课题研究的目的与意义 6
2 实验材料与方法 6
2.1 实验材料 6
2.2 副干酪乳杆菌素活性的检测 9
2.3 蛋白含量的测定 9
2.4 副干酪乳杆菌素的初步分离 10
2.5 超滤分离副干酪乳杆菌素 10
2.6 Sephadex G-100纯化副干酪乳杆菌素的研究 11
2.7 副干酪乳杆菌素分子量的测定（SDS-PAGE） 12
2.8 副干酪乳杆菌素的应用初探 13
3 实验结果与讨论 14
3.1 效价标准曲线的绘制 14
3.2 蛋白含量标准曲线的绘制 14
3.3 不同饱和度硫酸铵盐析对抑菌效果的影响 15
3.4 透析分离结果分析 16
3.5 Sephadex G-100 凝胶层析结果分析 17
3.6 副干酪乳杆菌素分子量分析 17
3.7 副干酪乳杆菌素的应用初探结果分析 18
结 论 20
致 谢 21
参 考 文 献 22
1 引言
近年来，食品安全问题已经成为人们越来越关注的热点问题。来自美国疾病控制和预防中心截止2006年报道显示：在美国每年大约有7600万人会发生食品中毒事件，死亡人数约5000人，而其中微生物引起的食物中毒占总事件的80%。我国的微生物污染也较为严重，每年仅果蔬腐败一 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
项引起的损失就达到750亿元[1]。
防止食品腐败变质，延长食品保质期的主要方法是添加食品防腐剂。从市场现有的防腐剂种类和来源上看，其主要是化学防腐剂，这类防腐剂在安全性和有效性上存在局限性，因此，寻找一种高效、广谱、安全的天然生物防腐剂称为食品科学的研究热点之一[2]。
乳酸菌是一种在食品发酵工业中广泛应用的益生菌。它可以抑制或杀死一些病原菌和食物腐败菌，有利于人的健康。近几年的研究表明有些乳酸菌均能分泌产生一种或多种抑菌物质，其中由核糖体合成的一类称为细菌素的具有抑菌活性的多肽或前体多肽，因其具有高效、无毒、无残留、无抗药性等优点己成为生物食品防腐研究的重点。乳酸菌素可以抑制食品中的致病菌，包括肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生利斯特氏菌等。因此，积极进行乳酸菌素的研究尤其是抑菌活性等方面的基础研究，不仅具有理论意义，而且具有非常广阔的应用前景。
1.1 乳酸菌细菌素概述
1.1.1 乳酸菌细菌素的发现及其开发利用现状
到目前为止，细菌素的定义尚无定论，普遍接受的观点是：细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成产生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽。细菌素（bacterioein）是1925年Gratia对大肠杆菌V菌株抑制巾菌株现象进行研究时发现的，以后Gratia和Frederieq对v菌株产生的抑制物质进行分离，发现这种物质类似于噬菌体，但不能够自主复制，Fredericq称其为大肠杆菌素。由于许多细菌能够产生类似的物质，Jocob将这类物质称为细菌素。1947年英国的Mattick A.T.R认识到血清学 N 群中一些乳酸链球菌（Streptococcus lactis）能够产生具有蛋白质性质的抑菌物质，并将其命名为“Nisin”，取自“Ninhibitorysubstance”；1953年Nisin的第一批商业产品Nisaplin在英国面市；1969年FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会批准Nisin可用作为一种食品添加剂。1983年，美国食品药物管理局（FDA）确定Nisin为公认安全产品（GRAS），并批准使用。欧盟也认定其为天然及安全性（E-234），Nisin在欧洲各国开始广泛使用。1990年我国卫生部食品监督部门签发了Nisin在国内使用的合格证明书，同时被列入国际GB2760-86的1990年增补品种中，可用于罐头食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品中[3]。目前，已经有50多个国家和地区批准Nisin可作为一种纯天然食品防腐剂、保鲜剂使用。
1.1.2 乳酸菌细菌素的种类
随着乳酸菌细菌素的研究深入，其分类也在不断改变。根据乳酸菌的种属不同而将其所产细菌素分为5类：（1）乳球菌属细菌素，包括乳链菌肽（Nisin）、乳球菌素（lactococcin）、乳链菌素（lacticin）。（2）片球菌属细菌素，它们均由片球菌属中的乳酸片球菌（Acidilactici）、戊糖片球菌（P.pentosaceus）和啤酒片球菌（P.cerevisia）产生。（3）明串珠菌属细菌素（4）肉食杆菌属细菌素（5）乳杆菌属细菌素，包括plantaricinA，B，C；plantaricinBN；sakacinA，M，P；lactocin Sbavara cinMN， ferme nticin，lact *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
acinF，lactacinB 等近 20 种。（6）其他乳酸菌细菌素，如嗜热链球菌代谢产生的物质等。
根据分子量、热敏感性和是否含修饰性氨基酸，将乳酸菌素大致分为4类：（1）羊毛硫抗生素（Lantibiotics）。分子量通常小于5 KDa，含有约19~50个氨基酸分子的肽类，显著特点是含有诸如羊毛硫氨酸（lanthionine）、脱氢丙氨酸 （dehydroalanine，DHa）、β-甲基羊毛硫氨酸（β-methyllanthionine）等非编码氨基酸。其中羊毛硫抗生素又分为2个亚类：A类是带有正电荷、疏水基团的肽类，它可以在细胞膜上形成通道，如nisin、lactacin481；B型细菌素是球状肽类，不带电荷或带负电荷，包括mersacidin，actagardine等。（2）小分子热稳定肽（small heat-stable peptide，SHSP）。分子量小于10 KDa，对热稳定。可分为4个亚类。（a）Ⅱa类：该亚类含有37~48个氨基酸，序列相似性为40%-60%，具有抗李斯特杆菌的活性。这些肽链可大致分为两个区：N-端高保守区和C-端低保守区，成熟细菌素N-末端氨基酸序列为Tyr-Gly-Asn-Gly-Val，并有两个半胱氨酸构成的S-S桥。（b）Ⅱｂ类：该亚类为双组分细菌素，由两个肽类寡聚体形成。又可分为两类：第一类双肽细菌素的每一个多肽都有活性，但多肽联合会增强它的活性；另一类型是活性依赖于两个多肽，任何一个单独多肽都没有活性。（c）Ⅱc类：此类细菌素属于分泌依赖型细菌素，该类细菌素前体 N-端为信号肽序列，通过GSP机制转运。（d）Ⅱd类：此类细菌素包括不属于上述任何一类的其它细菌素且分泌不需要前导肽或者信号肽。（3）大分子热敏感蛋白质（large heat labile protein，LHLP）。这类蛋白相对分子量大，通常大于3 KDa，100℃、30 min加热使其失活。只有少数该类细菌素有较为详细的报道。包括helveticin J，lactiin A，lactcin B。（4）复合细菌素。除需要蛋白部分外还需要其他如类脂、碳水化合物等化学成分维持活性。此类细菌素包括：lactocin 27，leucocin S等[5]。
1 引言 1
1.1 乳酸菌细菌素概述 2
1.2 乳酸菌细菌素分离纯化方法 3
1.3 乳酸菌细菌素的应用进展 5
1.4 课题研究的目的与意义 6
2 实验材料与方法 6
2.1 实验材料 6
2.2 副干酪乳杆菌素活性的检测 9
2.3 蛋白含量的测定 9
2.4 副干酪乳杆菌素的初步分离 10
2.5 超滤分离副干酪乳杆菌素 10
2.6 Sephadex G-100纯化副干酪乳杆菌素的研究 11
2.7 副干酪乳杆菌素分子量的测定（SDS-PAGE） 12
2.8 副干酪乳杆菌素的应用初探 13
3 实验结果与讨论 14
3.1 效价标准曲线的绘制 14
3.2 蛋白含量标准曲线的绘制 14
3.3 不同饱和度硫酸铵盐析对抑菌效果的影响 15
3.4 透析分离结果分析 16
3.5 Sephadex G-100 凝胶层析结果分析 17
3.6 副干酪乳杆菌素分子量分析 17
3.7 副干酪乳杆菌素的应用初探结果分析 18
结 论 20
致 谢 21
参 考 文 献 22
1 引言
近年来，食品安全问题已经成为人们越来越关注的热点问题。来自美国疾病控制和预防中心截止2006年报道显示：在美国每年大约有7600万人会发生食品中毒事件，死亡人数约5000人，而其中微生物引起的食物中毒占总事件的80%。我国的微生物污染也较为严重，每年仅果蔬腐败一 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
项引起的损失就达到750亿元[1]。
防止食品腐败变质，延长食品保质期的主要方法是添加食品防腐剂。从市场现有的防腐剂种类和来源上看，其主要是化学防腐剂，这类防腐剂在安全性和有效性上存在局限性，因此，寻找一种高效、广谱、安全的天然生物防腐剂称为食品科学的研究热点之一[2]。
乳酸菌是一种在食品发酵工业中广泛应用的益生菌。它可以抑制或杀死一些病原菌和食物腐败菌，有利于人的健康。近几年的研究表明有些乳酸菌均能分泌产生一种或多种抑菌物质，其中由核糖体合成的一类称为细菌素的具有抑菌活性的多肽或前体多肽，因其具有高效、无毒、无残留、无抗药性等优点己成为生物食品防腐研究的重点。乳酸菌素可以抑制食品中的致病菌，包括肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生利斯特氏菌等。因此，积极进行乳酸菌素的研究尤其是抑菌活性等方面的基础研究，不仅具有理论意义，而且具有非常广阔的应用前景。
1.1 乳酸菌细菌素概述
1.1.1 乳酸菌细菌素的发现及其开发利用现状
到目前为止，细菌素的定义尚无定论，普遍接受的观点是：细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成产生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽。细菌素（bacterioein）是1925年Gratia对大肠杆菌V菌株抑制巾菌株现象进行研究时发现的，以后Gratia和Frederieq对v菌株产生的抑制物质进行分离，发现这种物质类似于噬菌体，但不能够自主复制，Fredericq称其为大肠杆菌素。由于许多细菌能够产生类似的物质，Jocob将这类物质称为细菌素。1947年英国的Mattick A.T.R认识到血清学 N 群中一些乳酸链球菌（Streptococcus lactis）能够产生具有蛋白质性质的抑菌物质，并将其命名为“Nisin”，取自“Ninhibitorysubstance”；1953年Nisin的第一批商业产品Nisaplin在英国面市；1969年FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会批准Nisin可用作为一种食品添加剂。1983年，美国食品药物管理局（FDA）确定Nisin为公认安全产品（GRAS），并批准使用。欧盟也认定其为天然及安全性（E-234），Nisin在欧洲各国开始广泛使用。1990年我国卫生部食品监督部门签发了Nisin在国内使用的合格证明书，同时被列入国际GB2760-86的1990年增补品种中，可用于罐头食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品中[3]。目前，已经有50多个国家和地区批准Nisin可作为一种纯天然食品防腐剂、保鲜剂使用。
1.1.2 乳酸菌细菌素的种类
随着乳酸菌细菌素的研究深入，其分类也在不断改变。根据乳酸菌的种属不同而将其所产细菌素分为5类：（1）乳球菌属细菌素，包括乳链菌肽（Nisin）、乳球菌素（lactococcin）、乳链菌素（lacticin）。（2）片球菌属细菌素，它们均由片球菌属中的乳酸片球菌（Acidilactici）、戊糖片球菌（P.pentosaceus）和啤酒片球菌（P.cerevisia）产生。（3）明串珠菌属细菌素（4）肉食杆菌属细菌素（5）乳杆菌属细菌素，包括plantaricinA，B，C；plantaricinBN；sakacinA，M，P；lactocin Sbavara cinMN， ferme nticin，lact *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
acinF，lactacinB 等近 20 种。（6）其他乳酸菌细菌素，如嗜热链球菌代谢产生的物质等。
根据分子量、热敏感性和是否含修饰性氨基酸，将乳酸菌素大致分为4类：（1）羊毛硫抗生素（Lantibiotics）。分子量通常小于5 KDa，含有约19~50个氨基酸分子的肽类，显著特点是含有诸如羊毛硫氨酸（lanthionine）、脱氢丙氨酸 （dehydroalanine，DHa）、β-甲基羊毛硫氨酸（β-methyllanthionine）等非编码氨基酸。其中羊毛硫抗生素又分为2个亚类：A类是带有正电荷、疏水基团的肽类，它可以在细胞膜上形成通道，如nisin、lactacin481；B型细菌素是球状肽类，不带电荷或带负电荷，包括mersacidin，actagardine等。（2）小分子热稳定肽（small heat-stable peptide，SHSP）。分子量小于10 KDa，对热稳定。可分为4个亚类。（a）Ⅱa类：该亚类含有37~48个氨基酸，序列相似性为40%-60%，具有抗李斯特杆菌的活性。这些肽链可大致分为两个区：N-端高保守区和C-端低保守区，成熟细菌素N-末端氨基酸序列为Tyr-Gly-Asn-Gly-Val，并有两个半胱氨酸构成的S-S桥。（b）Ⅱｂ类：该亚类为双组分细菌素，由两个肽类寡聚体形成。又可分为两类：第一类双肽细菌素的每一个多肽都有活性，但多肽联合会增强它的活性；另一类型是活性依赖于两个多肽，任何一个单独多肽都没有活性。（c）Ⅱc类：此类细菌素属于分泌依赖型细菌素，该类细菌素前体 N-端为信号肽序列，通过GSP机制转运。（d）Ⅱd类：此类细菌素包括不属于上述任何一类的其它细菌素且分泌不需要前导肽或者信号肽。（3）大分子热敏感蛋白质（large heat labile protein，LHLP）。这类蛋白相对分子量大，通常大于3 KDa，100℃、30 min加热使其失活。只有少数该类细菌素有较为详细的报道。包括helveticin J，lactiin A，lactcin B。（4）复合细菌素。除需要蛋白部分外还需要其他如类脂、碳水化合物等化学成分维持活性。此类细菌素包括：lactocin 27，leucocin S等[5]。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/zygc/1540.html
