桦菌芝三萜化合物的纯化工艺研究(附件)
摘 要本课题主要对桦菌芝总三萜的大孔吸附树脂纯化工艺进行考察，通过单因素考察结合均匀设计实验确定和优化了纯化工艺中的最适合的大孔树脂型号、上样液的用量、上样液PH、上样液流速、上样液浓度、水洗除杂体积、色谱柱径高比、洗脱剂及洗脱剂的用量。结果表明，桦菌芝中三萜成分的最适合的大孔树脂型号为D101型，最佳洗脱工艺为上样量为3.4BV, 上样液PH为3,上样液浓度为4.31mg/ml，径高比为1:7，流速为1ml?min-1，3BV水洗除杂，6BV60 %的乙醇洗脱。此工艺条件下平均纯化率为53%左右。就现阶段发展而言，药用真菌资源的大力研究开发对医药行业的发展具有重要的意义，本实验的研究结果，为桦菌芝资源的进一步开发利用奠定了基础，也为药用真菌资源研究开发提供了参考。
目 录
1 绪论 1
1.1研究背景 1
1.2研究意义 1
1.3桦菌芝的简介 2
1.3.1植物形态及性状 2
1.3.3药理活性研究 2
1.4三萜类化合物的分离纯化 3
1.4.1吸附柱色谱法 3
1.4.2高效液相色谱法 4
1.4.3大孔吸附树脂法 4
1.5均匀设计法简介 4
1.5.1发展历程 4
1.5.2应用领域 5
1.5.3试验设计及数据处理 5
1.5.4均匀设计的优点 5
2 实验部分 6
2.1试药与仪器 6
2.1.1材料与试剂 6
2.1.2仪器 6
2.2实验条件的确定 6
2.2.1样品溶液的制备 6
2.2.2 对照品溶液的制备 6
2.2.3 显色反应 7
2.2.4 检测波长的确定 7
2.2.5精密度考察 7
2.2.6稳定性实验 7
2.2.7加样回收率实验 7
2.3实验方法 8
2.3.1总三萜粗提液的制备 8
2.3.2标准曲线的绘制 8
2.3.3总三萜的含量测定 9
2.3.4树脂的预处理 9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
2.3.5树脂型号的筛选 9
2.3.6均匀设计实验 11
2.3.7泄露曲线的绘制 12
2.3.8水洗条件研究 12
2.3.9洗脱条件选择 13
2.3.10最佳工艺验证 15
2.3.11树脂的再生 15
结 论 16
参考文献 17
致 谢 19
1 绪论
1.1 研究背景
真菌分为药用真菌和食用真菌，我国的真菌资源相当丰富，但是作为药用真菌的资源还是很少的，真菌作为一种纯天然的药用资源受到了越来越多的关注。全国中药资源普查表明[1]，我国有药用真菌 110 属，289 种，分属 50 科。传统药用及试验具有药效的真菌多达400 余种，目前已作药用的真菌除灵芝、茯苓、猪苓、雷丸、冬虫夏草、云芝等传统中药外，还有密环菌、薄树芝、灰树花、麦角菌等 20 多种。资料表明，药用菌可产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、酶、核酸、氨基酸、维生索以及植激素等多种生理性物质，这些物质对人的心血管、肝脏、神经、消化系统的多种疾病有较好的预防和治疗作用。随着药用菌的药理、药用成分逐步被揭示，使得药用菌真更加广泛地应用于医药、食品行业。
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng. ，又名木蹄、火绒层孔菌，属于担子菌门Basidiomycota，多孔菌目Polyporales，多孔菌科Polyporaceae，层孔菌属的大型真菌。广泛分布于我国东北、西南和西部等地区。其作为民间药物历史悠久，其性平、味微苦，具有消积、化瘀、抗癌的特性。桦菌芝中含有多种生物活性成分，化学预试表明[2], 桦菌芝中存在三萜类化合物、酚性成分、有机酸、糖、多糖和苷类、 内酯、香豆素及其苷类、蒽醌及其苷类等。其药用功能主要为退烧，消炎，止痛，抗肿瘤和治疗小儿积食。桦菌芝民间一直用做抗癌药物，目前尚未开发成新药制剂，其研究也多集中于其多糖抗肿瘤作用及作用机制的研究，对于桦菌芝中的其他成分及活性作用、新药研究报道较少。
1.2 研究意义
三萜类物质本身具有抗癌、抗肿瘤等多种生理活性，大多数的三萜存在于一些真菌中，现阶段已开发出一些以三萜类化合物为物质基础的药用真菌资源，又因其具有疗效好而副作用小的特点，这使得药用真菌资源的研究开发成为医药行业发展的重点，也成为促进新药研发的一个重要分支。虽然我国真菌资源丰富，但大多数的真菌还未被开发利用，所以大力研究开发出药用真菌资源具有十分重要的意义。本课题通过单因素考察结合均匀设计实验确定和优化了纯化工艺中的最适合的大孔树脂型号、上样液的用量、上样液PH、上样液流速、上样液浓度、水洗除杂体积、色谱柱径高比、洗脱剂及洗脱剂的用量等影响因素桦菌芝三萜化合物纯化的最佳工艺参数，其研究结果为以后药用真菌资源特别是桦菌芝资源的进一步开发和利用提供了参考和依据。
1.3 桦菌芝的简介
1.3.1 植物形态及性状
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng. 属于分布很广泛的多年生木腐性的大型真菌。生于栋、桦、杨、柳、锻、榆、水曲柳、梨、李、苹果等阔叶树干上或木桩上[4]。一般在生活环境比较阴湿或比较黑暗中出现棒状的畸形子实体。木蹄属担子果木生，多年生，无柄。其菌盖类似马蹄形，为灰色、浅褐色至黑色，菌盖上面有厚角质皮壳及环状棱纹，菌肉为铁锈色，质软蓬松，厚0.3~4 cm，菌管有多层，层次不明显，每层厚约3~5mm，颜色较菌肉浅，管孔呈圆形，灰色至浅褐色，无刚毛，每毫米3~4个;孢子长椭圆形，无色，14~17×5 μm。
1.3.2 化学成分研究
桦菌芝的药用部位是其子实体，其化学成分主要包括酚类, 三萜类化合物,有机酸, 糖、多糖和苷类, 植物甾醇、蒽醌及其苷类,内酯、香豆素及其苷类。Florentyna Wanda KudrzyckaBieloszabska [5]对木蹄层孔菌的各类分进行了定性显色检测，结果表明其子实体中含有甾醇、三萜、脂肪酸类和油脂类成分。黄天姿[6]等人运用硅胶、sephadex LH20 等柱色谱，从木蹄层孔菌子实体的乙醇提取物分离得到12 个化合物，通过单体的理化性质、NMR 和MS 技术鉴定显示桦菌芝中含有的成分有乙酰齐墩果酸、3十六碳酸酯7,22二烯麦角甾醇、白桦脂醇、棕榈酸、7,22二烯麦角甾3酮、麦角甾7,22二烯3醇、5,8过氧麦角甾6,22二烯3醇、3,3二甲氧基7,22二烯麦角烷、28乙酰白桦脂醇、十八烷酸、9,10二羟基十八烷酸、瑞香素。
1.3.3 药理活性研究
目 录
1 绪论 1
1.1研究背景 1
1.2研究意义 1
1.3桦菌芝的简介 2
1.3.1植物形态及性状 2
1.3.3药理活性研究 2
1.4三萜类化合物的分离纯化 3
1.4.1吸附柱色谱法 3
1.4.2高效液相色谱法 4
1.4.3大孔吸附树脂法 4
1.5均匀设计法简介 4
1.5.1发展历程 4
1.5.2应用领域 5
1.5.3试验设计及数据处理 5
1.5.4均匀设计的优点 5
2 实验部分 6
2.1试药与仪器 6
2.1.1材料与试剂 6
2.1.2仪器 6
2.2实验条件的确定 6
2.2.1样品溶液的制备 6
2.2.2 对照品溶液的制备 6
2.2.3 显色反应 7
2.2.4 检测波长的确定 7
2.2.5精密度考察 7
2.2.6稳定性实验 7
2.2.7加样回收率实验 7
2.3实验方法 8
2.3.1总三萜粗提液的制备 8
2.3.2标准曲线的绘制 8
2.3.3总三萜的含量测定 9
2.3.4树脂的预处理 9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
2.3.5树脂型号的筛选 9
2.3.6均匀设计实验 11
2.3.7泄露曲线的绘制 12
2.3.8水洗条件研究 12
2.3.9洗脱条件选择 13
2.3.10最佳工艺验证 15
2.3.11树脂的再生 15
结 论 16
参考文献 17
致 谢 19
1 绪论
1.1 研究背景
真菌分为药用真菌和食用真菌，我国的真菌资源相当丰富，但是作为药用真菌的资源还是很少的，真菌作为一种纯天然的药用资源受到了越来越多的关注。全国中药资源普查表明[1]，我国有药用真菌 110 属，289 种，分属 50 科。传统药用及试验具有药效的真菌多达400 余种，目前已作药用的真菌除灵芝、茯苓、猪苓、雷丸、冬虫夏草、云芝等传统中药外，还有密环菌、薄树芝、灰树花、麦角菌等 20 多种。资料表明，药用菌可产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、酶、核酸、氨基酸、维生索以及植激素等多种生理性物质，这些物质对人的心血管、肝脏、神经、消化系统的多种疾病有较好的预防和治疗作用。随着药用菌的药理、药用成分逐步被揭示，使得药用菌真更加广泛地应用于医药、食品行业。
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng. ，又名木蹄、火绒层孔菌，属于担子菌门Basidiomycota，多孔菌目Polyporales，多孔菌科Polyporaceae，层孔菌属的大型真菌。广泛分布于我国东北、西南和西部等地区。其作为民间药物历史悠久，其性平、味微苦，具有消积、化瘀、抗癌的特性。桦菌芝中含有多种生物活性成分，化学预试表明[2], 桦菌芝中存在三萜类化合物、酚性成分、有机酸、糖、多糖和苷类、 内酯、香豆素及其苷类、蒽醌及其苷类等。其药用功能主要为退烧，消炎，止痛，抗肿瘤和治疗小儿积食。桦菌芝民间一直用做抗癌药物，目前尚未开发成新药制剂，其研究也多集中于其多糖抗肿瘤作用及作用机制的研究，对于桦菌芝中的其他成分及活性作用、新药研究报道较少。
1.2 研究意义
三萜类物质本身具有抗癌、抗肿瘤等多种生理活性，大多数的三萜存在于一些真菌中，现阶段已开发出一些以三萜类化合物为物质基础的药用真菌资源，又因其具有疗效好而副作用小的特点，这使得药用真菌资源的研究开发成为医药行业发展的重点，也成为促进新药研发的一个重要分支。虽然我国真菌资源丰富，但大多数的真菌还未被开发利用，所以大力研究开发出药用真菌资源具有十分重要的意义。本课题通过单因素考察结合均匀设计实验确定和优化了纯化工艺中的最适合的大孔树脂型号、上样液的用量、上样液PH、上样液流速、上样液浓度、水洗除杂体积、色谱柱径高比、洗脱剂及洗脱剂的用量等影响因素桦菌芝三萜化合物纯化的最佳工艺参数，其研究结果为以后药用真菌资源特别是桦菌芝资源的进一步开发和利用提供了参考和依据。
1.3 桦菌芝的简介
1.3.1 植物形态及性状
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng. 属于分布很广泛的多年生木腐性的大型真菌。生于栋、桦、杨、柳、锻、榆、水曲柳、梨、李、苹果等阔叶树干上或木桩上[4]。一般在生活环境比较阴湿或比较黑暗中出现棒状的畸形子实体。木蹄属担子果木生，多年生，无柄。其菌盖类似马蹄形，为灰色、浅褐色至黑色，菌盖上面有厚角质皮壳及环状棱纹，菌肉为铁锈色，质软蓬松，厚0.3~4 cm，菌管有多层，层次不明显，每层厚约3~5mm，颜色较菌肉浅，管孔呈圆形，灰色至浅褐色，无刚毛，每毫米3~4个;孢子长椭圆形，无色，14~17×5 μm。
1.3.2 化学成分研究
桦菌芝的药用部位是其子实体，其化学成分主要包括酚类, 三萜类化合物,有机酸, 糖、多糖和苷类, 植物甾醇、蒽醌及其苷类,内酯、香豆素及其苷类。Florentyna Wanda KudrzyckaBieloszabska [5]对木蹄层孔菌的各类分进行了定性显色检测，结果表明其子实体中含有甾醇、三萜、脂肪酸类和油脂类成分。黄天姿[6]等人运用硅胶、sephadex LH20 等柱色谱，从木蹄层孔菌子实体的乙醇提取物分离得到12 个化合物，通过单体的理化性质、NMR 和MS 技术鉴定显示桦菌芝中含有的成分有乙酰齐墩果酸、3十六碳酸酯7,22二烯麦角甾醇、白桦脂醇、棕榈酸、7,22二烯麦角甾3酮、麦角甾7,22二烯3醇、5,8过氧麦角甾6,22二烯3醇、3,3二甲氧基7,22二烯麦角烷、28乙酰白桦脂醇、十八烷酸、9,10二羟基十八烷酸、瑞香素。
1.3.3 药理活性研究
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