pegna2so4双水相萃取木瓜蛋白酶(附件)
摘 要木瓜蛋白酶又叫木瓜酶，多存在于番木瓜的根茎和果实中，由于其具有较强的蛋白水解、合成和解脂能力，在食品、化工和医疗卫生等领域都得到广泛应用，因此对分离提取高纯度的木瓜蛋白酶进行研究是有非常重要的意义的。本研究采用PEG/Na2SO4双水相萃取法对木瓜蛋白酶进行提取，首先需要建立稳定的PEG/Na2SO4双水相体系，通过考察系统的酸碱度、各成相因素的浓度及成相高聚物的相对分子量等影响条件来确定该双水相系统中木瓜蛋白酶的最佳分配条件。以上述单因素实验为基础，获取最优的提取条件为：在常温下选择PEG相对分子量6000，PEG质量百分浓度15.0%，Na2SO4质量百分浓度15.0%，pH为中性（pH=7.0）时，所提取出的木瓜蛋白酶含量最高，活性最强。目 录
1 前言
1.1 番木瓜的简介 1
1.2 木瓜蛋白酶概述 1
1.2.1 木瓜蛋白酶的性质和结构组成 1
1.2.2 木瓜蛋白酶的应用 1
1.2.3 木瓜蛋白酶的提取方法 2
1.3 双水相萃取技术概述 3
1.3.1 双水相萃取简介 3
1.3.3 双水相萃取技术的应用 4
1.3.4 双水相萃取技术的局限和展望 5
1.4 课题研究意义 5
1.5 创新点 6
2 实验步骤及结果分析
2.1 主要材料与试剂 7
2.2 主要仪器 7
2.3 测定方法 7
2.3.1 木瓜蛋白酶活性的测定 7
2.3.2 蛋白质含量的测定 8
2.4 双水相萃取实验 9
2.5 单因素实验 10
2.5.1 不同pH的酶活性 10
2.5.2 不同成相物质质量分数对木瓜蛋白酶活性的影响 10
2.5.3 不同分子量PEG对分配行为的影响 11
2.5.4 Na2SO4质量分数对分配行为的影响 11
2.5.5 PEG质量分数对分配行为的影响 13
2.5.6 不同pH对分配行为的影响 13
结论 15
参考文献 16
致
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
/> 2.5.2 不同成相物质质量分数对木瓜蛋白酶活性的影响 10
2.5.3 不同分子量PEG对分配行为的影响 11
2.5.4 Na2SO4质量分数对分配行为的影响 11
2.5.5 PEG质量分数对分配行为的影响 13
2.5.6 不同pH对分配行为的影响 13
结论 15
参考文献 16
致 谢 18
1 前言
1.1 番木瓜的简介
被子植物番木瓜（Papaya），也叫做木瓜、石瓜。它既是一味药材，也是一种人们非常喜爱的食材，其味甘、性平，无毒，香甜可食。番木瓜原产于热带美洲和非洲，后来才引种到我国，经研究发现其主要活性成分包括有木瓜蛋白酶（Papain）、木瓜肽酶（Papaya Peptidase）和木瓜凝乳蛋白酶（Chymo Papain）等多种蛋白水解酶[1]。番木瓜中含量最高的活性成分主要是木瓜酶，多数分布于番木瓜的根茎和果肉中。由于该酶的水解能力很强，并且同时具有较强的解脂、合成等能力[2]，使其近些年来在食药保健和化工等领域中都得到了广泛的应用。
1.2 木瓜蛋白酶概述
1.2.1 木瓜蛋白酶的性质和结构组成
木瓜蛋白酶（Papain）又叫木瓜酶，是一种低特异性的蛋白水解酶，广泛存在于番木瓜未成熟果实的乳汁中，具有较强的蛋白水解、合成和解脂等能力[2]。木瓜蛋白酶的分子量约为2.7万，是一种含巯基（SH）肽链的由212个氨基酸残基组成的内切酶[3]，存在于酶活性中心部位的氨基酸残基至少有三个，分别是His 159、Asp 158、Cys 25，另外的六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键并且都不在活性部位[4]。木瓜蛋白酶具有酶活性强、热稳定性好、蛋白质水解能力强等特征，可用来改善植物蛋白的功能性质和营养价值。
1.2.2 木瓜蛋白酶的应用
1.2.2.1 在食品行业中的应用
在肉制品生产中，加入木瓜酶能够对该类制品中的弹性蛋白起较强的降解作用，可作为嫩肉粉使用。有研究证明，在所有嫩化添加剂中木瓜蛋白酶是添加剂量最少并且发挥效果最好的一种。此外，木瓜蛋白酶还在制备动物水解蛋白液等方面得到了广泛的应用[5]。
在啤酒生产过程中，加入木瓜酶可以非常有效地避免啤酒出现混浊等问题。这是由于啤酒属于一种胶体溶液，体系的不稳定使之极其容易变浑浊，这就需要加入一些物质来使溶液变得稳定，木瓜蛋白酶可以作为稳定剂来使用。在啤酒生产中添加木瓜蛋白酶，可以解决由于某些佐料溶解不完全而导致分解产物不足的问题，使啤酒的非生物稳定性得以提高 [6]。
在动物饲料的生产中，木瓜酶可以当做添加剂使用。在动物的饲料中加入木瓜酶可以更好地辅助蛋白质的吸收和转化，据有关报道称，木瓜蛋白酶添加到生长猪的日常粮食中可以有效增加猪的食欲，使猪群生长整齐，体毛光滑[7]。
1.2.2.2 在医疗卫生中的应用
在医疗领域，木瓜蛋白酶同样发挥了非常重要的作用。它可以促进胃消化，可以制成除虫药，还可以有效治疗烫伤、烧伤等各种类型的皮表组织损坏。在类似于冈比亚等医疗和药品都极度短缺的热带贫穷地区，当地居民如有烧伤烫伤，就会摘取木瓜敷到烫伤部位，利用果实中所含有的丰富的酶进行治疗恢复，能够有效地清除皮肤表面的溃烂组织，防止发炎感染。
除此以外，木瓜蛋白酶在兽药领域中也得到了新的应用。如某研究所与农业大学协作[8]，使用木瓜蛋白酶和抗菌药物对化脓的牛蹄进行治疗。接受治疗的病牛大多数都恢复良好。这是因为木瓜蛋白酶可以清除皮肤表面的结痂，使抗菌药物得以更好地发挥治疗作用。本次动物试验的成功，为木瓜蛋白酶在兽类领域的用药提供了重要的依据和先例。
1.2.2.3 在化工行业中的应用
在化工领域木瓜蛋白酶可以同乙二醇（PE）、新戊二醇（NPG）等多元醇配合，添加到日常清洁用品（如牙膏、化妆品等）中。这是利用该酶能够去除表皮角质的特性，使使用者达到皮肤白皙光滑。最具有代表性的像如今在市场上十分畅销的含有木瓜酶的香皂[9]。
很多研究证明，木瓜蛋白酶在多个行业中都发挥着不可或缺的作用，尤其是在食药行业上，它具有多种药理作用与功效（如可以抗癌、防止肝细胞坏死等），使木瓜蛋白酶在临床应用及食品保健方面有非常广阔的应用前景。因此我们需要不断地发掘木瓜蛋白酶的新用途，使其发挥更好的作用。
1.2.3 木瓜蛋白酶的提取方法
1.2.3.1 盐析沉淀法
盐析沉淀法可以用于蛋白质抗原的提取和浓缩，也可以用到一些蛋白酶的初步分离，该法可算作是最古老的分离方法之一。乙引[10]等应用此法对木瓜果实中的酶进行分离提纯，在各阶段分别提出了粗酶、精酶和纯化酶，可以在不同工业用途上得到应用。但是用这种方法提取所得的酶活性并不高，并且所得的酶制品含有工业用盐的臭气，若是不进行进一步处理无法符合食用酶的要求。
1.2.3.2 有机溶剂法
在不同条件下用一定质量分数的有机溶剂（如乙醇）提取木瓜蛋白酶，即有机溶剂法提取木瓜酶。任国梅[11]等在用有机溶剂法提取木瓜酶过程中，存在操作步骤烦琐、提取效率低等现象，并且蛋白酶在有机溶剂中极容易变性，所以用有机溶剂法制备木瓜酶还存在一定局限性。
1.2.3.3 双水相萃取法
1 前言
1.1 番木瓜的简介 1
1.2 木瓜蛋白酶概述 1
1.2.1 木瓜蛋白酶的性质和结构组成 1
1.2.2 木瓜蛋白酶的应用 1
1.2.3 木瓜蛋白酶的提取方法 2
1.3 双水相萃取技术概述 3
1.3.1 双水相萃取简介 3
1.3.3 双水相萃取技术的应用 4
1.3.4 双水相萃取技术的局限和展望 5
1.4 课题研究意义 5
1.5 创新点 6
2 实验步骤及结果分析
2.1 主要材料与试剂 7
2.2 主要仪器 7
2.3 测定方法 7
2.3.1 木瓜蛋白酶活性的测定 7
2.3.2 蛋白质含量的测定 8
2.4 双水相萃取实验 9
2.5 单因素实验 10
2.5.1 不同pH的酶活性 10
2.5.2 不同成相物质质量分数对木瓜蛋白酶活性的影响 10
2.5.3 不同分子量PEG对分配行为的影响 11
2.5.4 Na2SO4质量分数对分配行为的影响 11
2.5.5 PEG质量分数对分配行为的影响 13
2.5.6 不同pH对分配行为的影响 13
结论 15
参考文献 16
致
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
/> 2.5.2 不同成相物质质量分数对木瓜蛋白酶活性的影响 10
2.5.3 不同分子量PEG对分配行为的影响 11
2.5.4 Na2SO4质量分数对分配行为的影响 11
2.5.5 PEG质量分数对分配行为的影响 13
2.5.6 不同pH对分配行为的影响 13
结论 15
参考文献 16
致 谢 18
1 前言
1.1 番木瓜的简介
被子植物番木瓜（Papaya），也叫做木瓜、石瓜。它既是一味药材，也是一种人们非常喜爱的食材，其味甘、性平，无毒，香甜可食。番木瓜原产于热带美洲和非洲，后来才引种到我国，经研究发现其主要活性成分包括有木瓜蛋白酶（Papain）、木瓜肽酶（Papaya Peptidase）和木瓜凝乳蛋白酶（Chymo Papain）等多种蛋白水解酶[1]。番木瓜中含量最高的活性成分主要是木瓜酶，多数分布于番木瓜的根茎和果肉中。由于该酶的水解能力很强，并且同时具有较强的解脂、合成等能力[2]，使其近些年来在食药保健和化工等领域中都得到了广泛的应用。
1.2 木瓜蛋白酶概述
1.2.1 木瓜蛋白酶的性质和结构组成
木瓜蛋白酶（Papain）又叫木瓜酶，是一种低特异性的蛋白水解酶，广泛存在于番木瓜未成熟果实的乳汁中，具有较强的蛋白水解、合成和解脂等能力[2]。木瓜蛋白酶的分子量约为2.7万，是一种含巯基（SH）肽链的由212个氨基酸残基组成的内切酶[3]，存在于酶活性中心部位的氨基酸残基至少有三个，分别是His 159、Asp 158、Cys 25，另外的六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键并且都不在活性部位[4]。木瓜蛋白酶具有酶活性强、热稳定性好、蛋白质水解能力强等特征，可用来改善植物蛋白的功能性质和营养价值。
1.2.2 木瓜蛋白酶的应用
1.2.2.1 在食品行业中的应用
在肉制品生产中，加入木瓜酶能够对该类制品中的弹性蛋白起较强的降解作用，可作为嫩肉粉使用。有研究证明，在所有嫩化添加剂中木瓜蛋白酶是添加剂量最少并且发挥效果最好的一种。此外，木瓜蛋白酶还在制备动物水解蛋白液等方面得到了广泛的应用[5]。
在啤酒生产过程中，加入木瓜酶可以非常有效地避免啤酒出现混浊等问题。这是由于啤酒属于一种胶体溶液，体系的不稳定使之极其容易变浑浊，这就需要加入一些物质来使溶液变得稳定，木瓜蛋白酶可以作为稳定剂来使用。在啤酒生产中添加木瓜蛋白酶，可以解决由于某些佐料溶解不完全而导致分解产物不足的问题，使啤酒的非生物稳定性得以提高 [6]。
在动物饲料的生产中，木瓜酶可以当做添加剂使用。在动物的饲料中加入木瓜酶可以更好地辅助蛋白质的吸收和转化，据有关报道称，木瓜蛋白酶添加到生长猪的日常粮食中可以有效增加猪的食欲，使猪群生长整齐，体毛光滑[7]。
1.2.2.2 在医疗卫生中的应用
在医疗领域，木瓜蛋白酶同样发挥了非常重要的作用。它可以促进胃消化，可以制成除虫药，还可以有效治疗烫伤、烧伤等各种类型的皮表组织损坏。在类似于冈比亚等医疗和药品都极度短缺的热带贫穷地区，当地居民如有烧伤烫伤，就会摘取木瓜敷到烫伤部位，利用果实中所含有的丰富的酶进行治疗恢复，能够有效地清除皮肤表面的溃烂组织，防止发炎感染。
除此以外，木瓜蛋白酶在兽药领域中也得到了新的应用。如某研究所与农业大学协作[8]，使用木瓜蛋白酶和抗菌药物对化脓的牛蹄进行治疗。接受治疗的病牛大多数都恢复良好。这是因为木瓜蛋白酶可以清除皮肤表面的结痂，使抗菌药物得以更好地发挥治疗作用。本次动物试验的成功，为木瓜蛋白酶在兽类领域的用药提供了重要的依据和先例。
1.2.2.3 在化工行业中的应用
在化工领域木瓜蛋白酶可以同乙二醇（PE）、新戊二醇（NPG）等多元醇配合，添加到日常清洁用品（如牙膏、化妆品等）中。这是利用该酶能够去除表皮角质的特性，使使用者达到皮肤白皙光滑。最具有代表性的像如今在市场上十分畅销的含有木瓜酶的香皂[9]。
很多研究证明，木瓜蛋白酶在多个行业中都发挥着不可或缺的作用，尤其是在食药行业上，它具有多种药理作用与功效（如可以抗癌、防止肝细胞坏死等），使木瓜蛋白酶在临床应用及食品保健方面有非常广阔的应用前景。因此我们需要不断地发掘木瓜蛋白酶的新用途，使其发挥更好的作用。
1.2.3 木瓜蛋白酶的提取方法
1.2.3.1 盐析沉淀法
盐析沉淀法可以用于蛋白质抗原的提取和浓缩，也可以用到一些蛋白酶的初步分离，该法可算作是最古老的分离方法之一。乙引[10]等应用此法对木瓜果实中的酶进行分离提纯，在各阶段分别提出了粗酶、精酶和纯化酶，可以在不同工业用途上得到应用。但是用这种方法提取所得的酶活性并不高，并且所得的酶制品含有工业用盐的臭气，若是不进行进一步处理无法符合食用酶的要求。
1.2.3.2 有机溶剂法
在不同条件下用一定质量分数的有机溶剂（如乙醇）提取木瓜蛋白酶，即有机溶剂法提取木瓜酶。任国梅[11]等在用有机溶剂法提取木瓜酶过程中，存在操作步骤烦琐、提取效率低等现象，并且蛋白酶在有机溶剂中极容易变性，所以用有机溶剂法制备木瓜酶还存在一定局限性。
1.2.3.3 双水相萃取法
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