响应曲面法优选桦菌芝中三萜类化合物的提取工艺研究(附件)
本人签名： 日期： 摘 要桦菌芝是一种疗效明确的民间用药，可用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病，在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量。多数资料表明，桦菌芝抗癌的物质基础为其多糖类成分。目前对桦菌芝的研究主要集中在抗癌作用及其机制方面，对于桦菌芝化学成分的提取、分离纯化研究以及质量标准研究的报道较少。本次实验就是以桦菌芝为原料，采用响应面法优选桦菌芝中三萜类化合物的提取工艺。研究方法在单因素考察的基础上，利用三因素三水平响应面法研究提取温度、提取时间和乙醇浓度对桦菌芝中三萜类化合物提取率的影响。最终实验结果显示最佳提取工艺为：提取温度为70 ℃，提取时间为2 h，乙醇浓度为70%，桦菌芝中的三萜类化合物提取率为14.62%。通过响应面法优化的提取工艺方便简单，精密度良好，并且可以节省更多的人力和物力，为今后的科学研究提供便利。 目 录
1 绪论
1.1研究背景 8
1. 2研究目的 8
1.3研究意义 9
1.4桦菌芝的简介 9
1.4.1生物形态学特征及分布 9
1. 4.2化学成分 10
1.4.3药理作用 10
1.5三萜类化合物的提取方法 11
1.5.1超临界流体萃取法(SFE) 11
1.5.3超声波提取法 12
1.5.4超声循环提取法 12
1.5.5 微波萃取法 12
2实验部分
2.1试药与仪器 13
2.1.1材料与试剂 13
2.1.2仪器 13
2.2实验条件的确定 13
2.2.1样品溶液的制备 13
2.2.2对照品溶液的制备 13
2.2.3 显色反应 13
2.2.4 检测波长的确定 14
2.3桦菌芝中三萜类化合物提取率的测定 14
2.3.1 样品中三萜类化合物的检测 14
2.3.2样品液的测定 14
2.3.3标准曲线的绘制 14
2.4单因素对桦菌芝中三萜类化合物提取
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
2.2.2对照品溶液的制备 13
2.2.3 显色反应 13
2.2.4 检测波长的确定 14
2.3桦菌芝中三萜类化合物提取率的测定 14
2.3.1 样品中三萜类化合物的检测 14
2.3.2样品液的测定 14
2.3.3标准曲线的绘制 14
2.4单因素对桦菌芝中三萜类化合物提取率的影响 15
2.4.1提取温度对桦菌芝中三萜类化合物的影响 15
2.4.2提取时间对桦菌芝中三萜类化合物提取率的影响 16
2.4.3乙醇浓度对桦菌芝中三萜类化合物提取率的影响 16
2.5响应面法优化提取工艺 17
2.5.1响应面法的试验设计 17
2.5.2响应面组合设计及试验结果 17
2.5.3实验因素间的相互影响 18
2.6验证性实验 19
结论 21
参考文献 22
致谢 24
1 绪论
1.1研究背景
我国在利用与开发天然药物方面的历史己经有数千年了。几年，因为人类生存环境每况愈下的持续恶化，大量出现一些药源性疾病和疑难病。人们从天然药物中发现具有治病活性的化合物大多具有高效低毒的特点，进而人们越来越青睐研究天然药物。自然界中现存大约有2025万种真菌，真菌资源在我国颇为丰富，经记载已超过540种真菌在传统药用及试验验证是具有药效的，这些真菌大多数为担子菌亚门和子囊菌亚门。药用真菌是指具有药用价值、能治疗疾病的一类真菌:即对人体有保健作用，对疾病有预防、抑制或治疗作用的真菌，大型药用真菌目前约有300多种，已开发利用的大型药用真菌只有2030种因此，从真菌中开发具有低毒高效且资源充足可持续开发的药物前景良好。
桦菌芝(hropolyporus fomentarius)名木蹄、木蹄层孔菌、小驴蹄子，真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。多寄生于桦及栎的树干上，也生于杨、柳、赤杨、椴、榆等阔叶树的树干上。分布黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南、陕西、甘肃、新疆、四川、贵州、云南、广西等地，前苏联亦产。桦菌芝其性平，味微苦，水煎服，治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病。鉴于桦菌芝有特殊的作用，且目前对其化学成分的研究又少有报道，限制了对其产品的进一步开发，不利于产品附加值的提高。可以从化学资源的角度展开对其化学成分的系统研究。研究结果可增加人们对该真菌类化学成分的认识、化学资源的合理利用及真菌多孔菌科的化学分类均具有重要的理论意义和参考价值。
1. 2研究目的
三萜类化合物包括三萜烯及三萜皂苷，在自然界中分布很广，菌类、蕨类、单子叶和双子叶植物、动物及海洋生物中均有分布，尤以双子叶植物分布最多。它们以游离形式或者以与糖结合成苷或成酯的形式存在。药理研究证明，三萜类化合物具有广泛的生理活性，有保肝、抗肿瘤、抗HIV1及HIV1蛋白酶活性、抗带状疱疹病毒、增加免疫力等诸多功效。近年来，由于色谱等分离技术、波谱测定技术等分析手段的迅速发展，使三萜类化合物的提取分离及测定方法取得了可喜的研究进展。本次实验采用响应面法优化提取工艺，利用多元二次回归方程来拟合各种影响因素与响应值之间的函数关系[1]。在“直观，方便，高效”的特点下选出提取桦菌芝中三萜类化合物的最佳工艺，提高三萜类化合物的提取率。为今后探究桦菌芝中三萜类化合物提取工艺提供有价值的参考。
1.3研究意义
近年来，大量的学者对萜类化合物进行了研究，发现萜类化合物具有多种生物活性。但是对于这种资源丰富的药用真菌，我们了解的还不够，而且大部分都来源于野生，人工驯化栽培技术还不是十分成熟，还需要我们不断的完善，以备日后大规模的开发生产。还有真菌本身所含的成分极其复杂，结构各异，药效活性均不同，对其开发和利用的程度还要继续的深入，这就需要我们对其的研究更准确的进行鉴定和合理开发。因此，从天然药物中提取纯度高、活性强的萜类化合物意义重大。传统的溶剂提取法提取中药材时溶剂残留多，消耗能量大，不利于保护萜类化合物的活性，利用适当的新技术可以高效率的提取，扬长避短达到最佳的提取工艺。为从中药中提取萜类化合物开辟了新的途径，在萜类化合物提取工艺中有广阔的应用前景。使得桦菌芝为原料的成品类型更为广泛，提高经济价值和药用价值，服务社会。为进一步开发利用我国丰富的食用菌资源提供依据。桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量，本项目旨在筛选出桦菌芝多糖的最佳提取工艺条件，期用较低的成本得到含量较高的桦菌芝多糖，为桦菌芝资源的开发利用特别是新制剂或新药的研发奠定基础。本课题的开展及后期成果的取得，对于进一步合理利用、开发桦菌芝资源具有重要的意义，对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
1.4桦菌芝的简介
1.4.1生物形态学特征及分布
桦菌芝(Phropolyporus fomentarius)，多孔菌科植物木蹄的菌体，隶属于多孔菌科。其药名有多种记载，在《中国药用真菌》名为木蹄，在《中国真菌总汇》名为木蹄层孔菌，在《孢子植物名称》名为木紫芝，在《陕西中草药》名为桦菌芝，还有其他名称。例如：木蹄层孔菌、湖北名木菌、吉林名火绒菌，引火菌等等。桦菌芝以菌体入药，6～7月采集，晒干。手摸干燥子实体表面坚硬、菌管硬而脆、菌肉松软，菌肉木栓质，锈
1 绪论
1.1研究背景 8
1. 2研究目的 8
1.3研究意义 9
1.4桦菌芝的简介 9
1.4.1生物形态学特征及分布 9
1. 4.2化学成分 10
1.4.3药理作用 10
1.5三萜类化合物的提取方法 11
1.5.1超临界流体萃取法(SFE) 11
1.5.3超声波提取法 12
1.5.4超声循环提取法 12
1.5.5 微波萃取法 12
2实验部分
2.1试药与仪器 13
2.1.1材料与试剂 13
2.1.2仪器 13
2.2实验条件的确定 13
2.2.1样品溶液的制备 13
2.2.2对照品溶液的制备 13
2.2.3 显色反应 13
2.2.4 检测波长的确定 14
2.3桦菌芝中三萜类化合物提取率的测定 14
2.3.1 样品中三萜类化合物的检测 14
2.3.2样品液的测定 14
2.3.3标准曲线的绘制 14
2.4单因素对桦菌芝中三萜类化合物提取
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
2.2.2对照品溶液的制备 13
2.2.3 显色反应 13
2.2.4 检测波长的确定 14
2.3桦菌芝中三萜类化合物提取率的测定 14
2.3.1 样品中三萜类化合物的检测 14
2.3.2样品液的测定 14
2.3.3标准曲线的绘制 14
2.4单因素对桦菌芝中三萜类化合物提取率的影响 15
2.4.1提取温度对桦菌芝中三萜类化合物的影响 15
2.4.2提取时间对桦菌芝中三萜类化合物提取率的影响 16
2.4.3乙醇浓度对桦菌芝中三萜类化合物提取率的影响 16
2.5响应面法优化提取工艺 17
2.5.1响应面法的试验设计 17
2.5.2响应面组合设计及试验结果 17
2.5.3实验因素间的相互影响 18
2.6验证性实验 19
结论 21
参考文献 22
致谢 24
1 绪论
1.1研究背景
我国在利用与开发天然药物方面的历史己经有数千年了。几年，因为人类生存环境每况愈下的持续恶化，大量出现一些药源性疾病和疑难病。人们从天然药物中发现具有治病活性的化合物大多具有高效低毒的特点，进而人们越来越青睐研究天然药物。自然界中现存大约有2025万种真菌，真菌资源在我国颇为丰富，经记载已超过540种真菌在传统药用及试验验证是具有药效的，这些真菌大多数为担子菌亚门和子囊菌亚门。药用真菌是指具有药用价值、能治疗疾病的一类真菌:即对人体有保健作用，对疾病有预防、抑制或治疗作用的真菌，大型药用真菌目前约有300多种，已开发利用的大型药用真菌只有2030种因此，从真菌中开发具有低毒高效且资源充足可持续开发的药物前景良好。
桦菌芝(hropolyporus fomentarius)名木蹄、木蹄层孔菌、小驴蹄子，真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。多寄生于桦及栎的树干上，也生于杨、柳、赤杨、椴、榆等阔叶树的树干上。分布黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南、陕西、甘肃、新疆、四川、贵州、云南、广西等地，前苏联亦产。桦菌芝其性平，味微苦，水煎服，治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病。鉴于桦菌芝有特殊的作用，且目前对其化学成分的研究又少有报道，限制了对其产品的进一步开发，不利于产品附加值的提高。可以从化学资源的角度展开对其化学成分的系统研究。研究结果可增加人们对该真菌类化学成分的认识、化学资源的合理利用及真菌多孔菌科的化学分类均具有重要的理论意义和参考价值。
1. 2研究目的
三萜类化合物包括三萜烯及三萜皂苷，在自然界中分布很广，菌类、蕨类、单子叶和双子叶植物、动物及海洋生物中均有分布，尤以双子叶植物分布最多。它们以游离形式或者以与糖结合成苷或成酯的形式存在。药理研究证明，三萜类化合物具有广泛的生理活性，有保肝、抗肿瘤、抗HIV1及HIV1蛋白酶活性、抗带状疱疹病毒、增加免疫力等诸多功效。近年来，由于色谱等分离技术、波谱测定技术等分析手段的迅速发展，使三萜类化合物的提取分离及测定方法取得了可喜的研究进展。本次实验采用响应面法优化提取工艺，利用多元二次回归方程来拟合各种影响因素与响应值之间的函数关系[1]。在“直观，方便，高效”的特点下选出提取桦菌芝中三萜类化合物的最佳工艺，提高三萜类化合物的提取率。为今后探究桦菌芝中三萜类化合物提取工艺提供有价值的参考。
1.3研究意义
近年来，大量的学者对萜类化合物进行了研究，发现萜类化合物具有多种生物活性。但是对于这种资源丰富的药用真菌，我们了解的还不够，而且大部分都来源于野生，人工驯化栽培技术还不是十分成熟，还需要我们不断的完善，以备日后大规模的开发生产。还有真菌本身所含的成分极其复杂，结构各异，药效活性均不同，对其开发和利用的程度还要继续的深入，这就需要我们对其的研究更准确的进行鉴定和合理开发。因此，从天然药物中提取纯度高、活性强的萜类化合物意义重大。传统的溶剂提取法提取中药材时溶剂残留多，消耗能量大，不利于保护萜类化合物的活性，利用适当的新技术可以高效率的提取，扬长避短达到最佳的提取工艺。为从中药中提取萜类化合物开辟了新的途径，在萜类化合物提取工艺中有广阔的应用前景。使得桦菌芝为原料的成品类型更为广泛，提高经济价值和药用价值，服务社会。为进一步开发利用我国丰富的食用菌资源提供依据。桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量，本项目旨在筛选出桦菌芝多糖的最佳提取工艺条件，期用较低的成本得到含量较高的桦菌芝多糖，为桦菌芝资源的开发利用特别是新制剂或新药的研发奠定基础。本课题的开展及后期成果的取得，对于进一步合理利用、开发桦菌芝资源具有重要的意义，对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
1.4桦菌芝的简介
1.4.1生物形态学特征及分布
桦菌芝(Phropolyporus fomentarius)，多孔菌科植物木蹄的菌体，隶属于多孔菌科。其药名有多种记载，在《中国药用真菌》名为木蹄，在《中国真菌总汇》名为木蹄层孔菌，在《孢子植物名称》名为木紫芝，在《陕西中草药》名为桦菌芝，还有其他名称。例如：木蹄层孔菌、湖北名木菌、吉林名火绒菌，引火菌等等。桦菌芝以菌体入药，6～7月采集，晒干。手摸干燥子实体表面坚硬、菌管硬而脆、菌肉松软，菌肉木栓质，锈
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