凹叶厚朴内生真菌纯化与复壮(附件)
摘 要本实验通过对凹叶厚朴内生真菌的纯化、复壮及初步鉴定，对凹叶厚朴内生真菌进行初步研究，进一步丰富凹叶厚朴内生真菌种群的多样性，研究复壮前后菌种形态变化，推动凹叶厚朴内生真菌的研究发展，使其更加深入，全面，并对于尝试利用内生真菌开发新药源有很好的发展前景。为合理利用凹叶厚朴药用成分及保护凹叶厚朴药用植物资源提供理论依据。本实验采用马铃薯(CPDA)培养基对33株凹叶厚朴内生真菌进行纯化及复壮，结果复壮成功32株，表明原始菌种保藏时间及保藏方式对菌种的纯化及复壮有很大的影响，应该定期（3~5个月）进行纯化及复壮，且在反复纯化、复壮的过程中，通过观察菌落形态以及显微形态，表明无菌操作规范，培养的方法（CPDA培养基，28℃培养）比较适合凹叶厚朴内生真菌菌种的生长。采用插片法对其进行形态学观察，对其分类地位进行初步鉴定。 目 录
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴植物的简介 1
1.2 内生真菌研究进展与分析 1
1.2.1 植物内生真菌 1
1.2.2 内生真菌与植物的关系 2
1.2.3 菌种的保藏 2
1.2.4 菌种的复壮 4
1.2.5 菌种的衰退 5
1.3 小结 5
2 实验部分
2.1 实验材料 7
2.1.1 供试菌种 7
2.1.2 培养基 7
2.1.3 实验仪器及试剂 7
2.2 实验方法 8
2.2.1 菌种纯化 8
2.2.2 菌种复壮 8
2.2.3 菌种保藏 8
2.2.4 菌种显微鉴定 8
2.3 结果与分析 9
2.3.1 菌种纯化及复壮过程中的生长状况 9
2.3.2 菌种显微形态观察及鉴定结果 12
2.3.3 菌种纯化及复壮的存活分析 15
2.3.4 结果分析 16
结论 18
参考文献 19
致谢 22
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴植物的简介
凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.e
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
况 9
2.3.2 菌种显微形态观察及鉴定结果 12
2.3.3 菌种纯化及复壮的存活分析 15
2.3.4 结果分析 16
结论 18
参考文献 19
致谢 22
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴植物的简介
凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)为多年生禾本科植物，为木兰科木兰属植物厚朴的一个亚种[1]，是我国特产树种，是我国的二级重点保护野生植物。凹叶厚朴是我国特有的、珍贵的传统中药材，是传统中医学和日本汉方医学广泛使用的一味药物。中药厚朴为木兰科厚朴和凹叶厚朴的干皮、根皮及枝皮[2]。凹叶厚朴其性温，味苦、辛[3]，可用于湿滞伤中、脘痞吐泻、食积气滞、痰饮喘咳、消炎灭菌、胸腹胀满[4]等症，临床多用来治疗细菌感染，炎症和胃肠道疾病等[5]。其主要药效成分是厚朴酚与和厚朴酚[6]，两种化合物均具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗神经变性、抗抑郁等多种药理活性[7]。因此凹叶厚朴被越来越多的开发利用。而在采收树龄上，凹叶厚朴为多年生落叶乔木，生长周期长，一般要生长15年以上才能剥皮供药用，其采集方式主要靠砍树剥皮[8]，然而近年来对于厚朴及凹叶厚朴药理活性的研究深入，药材需求量的不断增加，大批凹叶厚朴未到采种年龄就被提前砍伐，由于过度滥伐森林和大量剥去树皮药用，导致凹叶厚朴的分布范围迅速缩小，成年野生植株极少见，已处于濒危状况，供需矛盾日益突出。这也给凹叶厚朴资源带来严重威胁，大量滥用凹叶厚朴植株，必然严重导致生态失衡，造成对森林和人类环境以及生物多样性不可弥补的损失。
1.2 内生真菌研究进展与分析
1.2.1 植物内生真菌
植物内生菌概念最早是由De Bary[9]提出的，是寄存在在植物体的微生物，主要用于区别表面细菌与植物组织的生活之间的差异，包括内生真菌和内生细菌[10]。1986年Carroll将内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内并不引起明显病害症状的真菌，突出强调内生菌与植物的互惠共生关系，因此，在这个内生菌概念的范畴内不包含植物致病菌和菌根菌[11]。1991年Petrini把Carroll的概念范畴进一步扩展，将内生菌定义为那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害状的菌，这个定义包括那些在其生活史中的某一阶段营表面生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌[12]。1996年Bills也认为一些类型的菌根菌，如内外生菌根菌，杜鹃菌根菌和假菌根菌，应属于内生菌[13]。内生真菌是指在其生命周期的过程中，或他们生活中的一部分的生命周期中，在健康植物组织内部，不会使宿主植物对真菌感染症状比较明显的一类真菌[14]。它是生活在植物组织内的一类微生物，是植物微生态系统中的天然组成成分，且长期生活在植物体内的特殊环境中，与寄主协同进化, 根据内共生理论，内生真菌可能产生与宿主相同或相似的具有生物活性的次生代谢产物[15]。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出来第一株内生真菌至今，关于内生真菌研究已有一百多年的历史[16]，但是从1890至1980除少数几篇有关内生真菌的研究报道外，很少有人涉及到这一领域的研究，直到1993年，美国蒙大拿州立大学的Strobel小组在短叶红豆杉内生真菌中发现紫杉醇[17] 国内外掀起对药用植物和濒危植物内生真菌的研究热潮，二十年来，人们开始关注并进行内生真菌的研究。
1.2.2 内生真菌与植物的关系
内生真菌与寄主植株在长期的协同进化过程中，形成一种共同生存共同得利的关系。一方面，内生真菌次生代谢产物的产生可以帮助植物抵抗病虫害和环境的破坏等，在植物的生长发育和自然界的系统进化中发挥着极其重要的作用；另一方面，植物可以给内生真菌的生长发育提供必要的成长环境[18]。内生真菌能产生具有生物活性的次级代谢产物，其相同或相似于寄主植物，这种结果与寄主植物的影响是有很大关系的，但由于内生真菌与宿主植物共生关系的复杂性，在相对稳定的生活环境的内生真菌还是比较稳定的，所以内生真菌与植物之间的互相生存，相互得利关系的作用机制尚未完全被掌握。药用植物内生真菌，可以产生与寄主植物相同或相似的生物活性物质的协同进化机制，在近年来的研究中主要包括“内共生理论”和“两种基因转移理论”[19]。
1.2.3 菌种的保藏
菌种保藏最早定义为非天然状态下保藏纯的微生物标本。目前该概念已延伸到保藏遗传形状稳定的细胞系、杂交瘤和菌株标本的DNA、RNA和蛋白质等物质[20]。菌种的保藏方法有斜面低温保藏法，液体石蜡保藏法，沙土保藏法，液氮冷冻保藏法，冷冻干燥保藏法等[21]。
1.2.3.1 斜面低温保藏法
保藏方法：将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2~8℃的冰箱中保藏。优点：操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴植物的简介 1
1.2 内生真菌研究进展与分析 1
1.2.1 植物内生真菌 1
1.2.2 内生真菌与植物的关系 2
1.2.3 菌种的保藏 2
1.2.4 菌种的复壮 4
1.2.5 菌种的衰退 5
1.3 小结 5
2 实验部分
2.1 实验材料 7
2.1.1 供试菌种 7
2.1.2 培养基 7
2.1.3 实验仪器及试剂 7
2.2 实验方法 8
2.2.1 菌种纯化 8
2.2.2 菌种复壮 8
2.2.3 菌种保藏 8
2.2.4 菌种显微鉴定 8
2.3 结果与分析 9
2.3.1 菌种纯化及复壮过程中的生长状况 9
2.3.2 菌种显微形态观察及鉴定结果 12
2.3.3 菌种纯化及复壮的存活分析 15
2.3.4 结果分析 16
结论 18
参考文献 19
致谢 22
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴植物的简介
凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.e
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
况 9
2.3.2 菌种显微形态观察及鉴定结果 12
2.3.3 菌种纯化及复壮的存活分析 15
2.3.4 结果分析 16
结论 18
参考文献 19
致谢 22
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴植物的简介
凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)为多年生禾本科植物，为木兰科木兰属植物厚朴的一个亚种[1]，是我国特产树种，是我国的二级重点保护野生植物。凹叶厚朴是我国特有的、珍贵的传统中药材，是传统中医学和日本汉方医学广泛使用的一味药物。中药厚朴为木兰科厚朴和凹叶厚朴的干皮、根皮及枝皮[2]。凹叶厚朴其性温，味苦、辛[3]，可用于湿滞伤中、脘痞吐泻、食积气滞、痰饮喘咳、消炎灭菌、胸腹胀满[4]等症，临床多用来治疗细菌感染，炎症和胃肠道疾病等[5]。其主要药效成分是厚朴酚与和厚朴酚[6]，两种化合物均具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗神经变性、抗抑郁等多种药理活性[7]。因此凹叶厚朴被越来越多的开发利用。而在采收树龄上，凹叶厚朴为多年生落叶乔木，生长周期长，一般要生长15年以上才能剥皮供药用，其采集方式主要靠砍树剥皮[8]，然而近年来对于厚朴及凹叶厚朴药理活性的研究深入，药材需求量的不断增加，大批凹叶厚朴未到采种年龄就被提前砍伐，由于过度滥伐森林和大量剥去树皮药用，导致凹叶厚朴的分布范围迅速缩小，成年野生植株极少见，已处于濒危状况，供需矛盾日益突出。这也给凹叶厚朴资源带来严重威胁，大量滥用凹叶厚朴植株，必然严重导致生态失衡，造成对森林和人类环境以及生物多样性不可弥补的损失。
1.2 内生真菌研究进展与分析
1.2.1 植物内生真菌
植物内生菌概念最早是由De Bary[9]提出的，是寄存在在植物体的微生物，主要用于区别表面细菌与植物组织的生活之间的差异，包括内生真菌和内生细菌[10]。1986年Carroll将内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内并不引起明显病害症状的真菌，突出强调内生菌与植物的互惠共生关系，因此，在这个内生菌概念的范畴内不包含植物致病菌和菌根菌[11]。1991年Petrini把Carroll的概念范畴进一步扩展，将内生菌定义为那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害状的菌，这个定义包括那些在其生活史中的某一阶段营表面生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌[12]。1996年Bills也认为一些类型的菌根菌，如内外生菌根菌，杜鹃菌根菌和假菌根菌，应属于内生菌[13]。内生真菌是指在其生命周期的过程中，或他们生活中的一部分的生命周期中，在健康植物组织内部，不会使宿主植物对真菌感染症状比较明显的一类真菌[14]。它是生活在植物组织内的一类微生物，是植物微生态系统中的天然组成成分，且长期生活在植物体内的特殊环境中，与寄主协同进化, 根据内共生理论，内生真菌可能产生与宿主相同或相似的具有生物活性的次生代谢产物[15]。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出来第一株内生真菌至今，关于内生真菌研究已有一百多年的历史[16]，但是从1890至1980除少数几篇有关内生真菌的研究报道外，很少有人涉及到这一领域的研究，直到1993年，美国蒙大拿州立大学的Strobel小组在短叶红豆杉内生真菌中发现紫杉醇[17] 国内外掀起对药用植物和濒危植物内生真菌的研究热潮，二十年来，人们开始关注并进行内生真菌的研究。
1.2.2 内生真菌与植物的关系
内生真菌与寄主植株在长期的协同进化过程中，形成一种共同生存共同得利的关系。一方面，内生真菌次生代谢产物的产生可以帮助植物抵抗病虫害和环境的破坏等，在植物的生长发育和自然界的系统进化中发挥着极其重要的作用；另一方面，植物可以给内生真菌的生长发育提供必要的成长环境[18]。内生真菌能产生具有生物活性的次级代谢产物，其相同或相似于寄主植物，这种结果与寄主植物的影响是有很大关系的，但由于内生真菌与宿主植物共生关系的复杂性，在相对稳定的生活环境的内生真菌还是比较稳定的，所以内生真菌与植物之间的互相生存，相互得利关系的作用机制尚未完全被掌握。药用植物内生真菌，可以产生与寄主植物相同或相似的生物活性物质的协同进化机制，在近年来的研究中主要包括“内共生理论”和“两种基因转移理论”[19]。
1.2.3 菌种的保藏
菌种保藏最早定义为非天然状态下保藏纯的微生物标本。目前该概念已延伸到保藏遗传形状稳定的细胞系、杂交瘤和菌株标本的DNA、RNA和蛋白质等物质[20]。菌种的保藏方法有斜面低温保藏法，液体石蜡保藏法，沙土保藏法，液氮冷冻保藏法，冷冻干燥保藏法等[21]。
1.2.3.1 斜面低温保藏法
保藏方法：将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2~8℃的冰箱中保藏。优点：操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染
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