响应面法筛选厚朴内生真菌发酵培养的c源及n源(附件)
摘 要厚朴内生真菌能够产生与宿主相同或相似的代谢产物，但产量较低，本实验利用响应面法筛选厚朴内生真菌发酵的最佳C源、N源及生长因子。用单因素的方法，选出最适的C源、N源及生长因子。以厚朴酚标准品为对照，用响应面法对最终的因变量和自变量进行分析，建立数学模型，筛选出最佳C源、N源及生长因子的比例。通过单因素实验的方法挑选出最优C源是蔗糖，最优N源是硝酸铵，最优生长因子是矮壮素。以蔗糖20-40g、硝酸铵20-60g、矮壮素2.5-7.5g为自变量，用高效液相色谱法(HPLC)检测的实验数据为基准，通过使用Design-Expert.V8.0.6.1软件来得出相应的响应面后进一步筛选出三个因素的最佳比为20:40:5，经发酵培养得到的最佳配比含量为217×10-8g/mL，空白对照品的含量为188×10-8g/mL。该方法能有效的提高厚朴内生真菌发酵培养的代谢产物量。
目 录
1 文献综述 1
1.1 厚朴的简介 1
1.2 厚朴的化学成分 1
1.2.1 酚类 1
1.2.2 生物碱类 1
1.2.3 挥发油类 1
1.2.4 其他 1
1.3 植物内生真菌 2
1.4 发酵培养的C源及N源 2
2 实验部分 4
2.1 实验材料 4
2.1.1 菌种 4
2.1.2 实验试剂 4
2.1.3 实验设备 4
2.1.4 培养基及主要溶液的配制 4
2.2 实验方法 4
2.2.1 单因素实验 5
2.2.2 标准曲线的建立 6
2.2.3 响应面法 6
2.3 实验结果 6
2.3.1 对照品与空白的测定 6
2.3.2 单因素测定结果 10
2.3.3 HPLC测定结果 12
2.3.4 响应面测定结果 12
2.4 讨论 17
2.4.1 单因素实验分析 18
2.4.2 响应面法分析 18
结论 20
参考文献 21
致谢 2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
3
文献综述
厚朴的简介
厚朴是我国特有的珍贵树种之一[1]，它的树皮、根皮、花、种子及芽皆可入药[2]，厚朴性温，味苦辛[3]。主要成分厚朴酚、和厚朴酚[4]，存在的药用价值还都很高。厚朴中药材在临床上使用较为广泛，以厚朴为配方的中成药就多达二百多种[5]。
由于市场对厚朴的需求日益增加，但是厚朴生长缓慢、供应不足[6]，虽然国内以及部分地区大面积、大规模的种植，但从长远来看，远远不能满足生产所需[7]。通过开发新的研究方法，进一步提高厚朴的资源利用率。
厚朴的化学成分
酚类
厚朴中含有多种酚类物质，在厚朴的活性成分中占有5%[8]的比例，其中主要的活性物质以厚朴酚、和厚朴酚为主，还含有四氢厚朴酚、以厚朴酚、龙脑基厚朴酚、辣薄荷基厚朴酚、厚朴木质素AI、厚朴三醇、厚朴醛BE、台湾檫木醛、2,2二羟基5烯丙基连苯5丙烯醛、丁香脂素、2,2,5三羟基5烯丙基连二苯、8,9二羟基二氢和厚朴酚、8,9二羟基7甲氧基二氢和厚朴酚等[9]。
生物碱类
厚朴中含有的生物碱类成分以厚朴碱为主，还存在木兰花碱(Magnoflorine)、武当木兰花碱(Magnosprengerine)、白兰花碱(Michelalbine)、木兰箭毒碱(Magnocurarine)、氧化黄心树宁碱、N降荷叶碱、番荔枝碱、鹅掌楸碱、罗默碱、瑞枯灵及阿朴啡生物碱类化合物等[10]。
挥发油类
厚朴中含有的挥发油存在多种化学成分，有α蒎烯、β蒎烯、D柠檬烯、樟烯等[11]，其中大多数为有效成分。经气相色谱质谱联用仪(GCMS)鉴定出48种化合物，其中以桉叶醇以及其异构体异桉叶醇的含量最高[12]。
其它
厚朴中可以分离得到芦丁、棕榈酮、榔皮苷、花生酸、二十六烷醇、胡萝卜
苷[13]。从厚朴中还可以分离得到1(4羟基3甲氧基苯基)2[4(w羟丙基)2甲氧基苯氧基]1,3苯二醇[14]。
植物内生真菌
人们对于植物内生真菌(Plantendophyticfungi)已经有了上百年的研究经验。关于对内生真菌的研究，人们起初是源于对黑麦草等牧草上产生的生物碱类毒素的内生真菌引起的家畜病毒，直到20世纪80年代依然还是很少有涉及到这个领域的研究[15]。1993年，美国蒙拿大大学植物病理学系Stierle研究小组从药用植物太平洋红豆杉树皮中仅分离得到了一株具有合成与宿主细胞相同的抗癌药物(紫杉醇的内生真菌) [16]。
目前，内生真菌代谢产物能够产生与宿主相同或相似的代谢产物，但发酵产物的含量均较低，不能够满足工业需求。大多研究者都投身于对内生真菌发酵培养进行研究。
发酵培养的C源及N源
对于真菌来说，最主要的营养物质为C源、N源、生长因子。对于真菌来说，C源可提供物质、能量；N源影响繁殖、休眠(死亡)；生长因子可提供所需的微量元素。调查发现大部分研究者都以C源、N源、生长因子作为研究对象，研究植物内生真菌的发酵影响。
马思佳等[17]通过对培养基中不同C源的选择来对活性污泥微生物细胞膜特性和菌落结构进行研究影响。试验结果表明：不同的C源会影响微生物合成的磷脂脂肪酸(PLFA)。最终实验结果得到：蛋白胨可以作为最佳C源来让活性污泥生物菌落结构多样性增加的。
林壁润等[18]通过对万隆霉素产生菌发酵培养所需的C源、N源试验。试验显示：抗万隆霉素筛选出的C源为糊精、大米粉。筛选出的N源为酵母膏、玉米浆。
宾冬梅等[19]在啤酒糟培养基中加入不同的C源、N源，并且适当的改变它的比例。试验显示：C源：6%乳糖；N源：4%胰蛋白胨。
罗玮等[20]以培养基的C源、N源等我研究对象进行试验。通过单因素、正交设计的方法去筛选出各物质比例。试验显示：最佳C源为玉米粉；最佳N源为黄豆粉。
关于厚朴内生真菌代谢产物发酵培养条件的优化相关研究文献较少，过去大家大多都是对紫杉醇，鱼腥草等一些植物进行了研究。综上所述，发现内生真菌厚朴酚的研究报道相对较少，因此本文对厚朴内生真菌的发酵所需的条件进行了优化。本文拟选用的C源有蔗糖、玉米粉、小麦粉、β环糊精、淀粉；拟选用的N源有蛋白胨、硝酸铵、硝酸钠、酵母浸粉、草酸铵；拟选用的生长因子有赤霉素、矮壮素、维生素C、维生素B1。
本文主要用响应面的方法来对厚朴内生真菌所需的营养物质(C源，N源及生长因子)的含量进行研究。并通过使用HPLC法测定厚朴酚的含量作为依据，从而优化得到了厚朴内生真菌发酵培养的C源、N源及生长因子的比例，为实际生产提供一个有利的依据。
实验部分
实验材料
菌种
陕西国际商贸学院5#502微生物实验室：YX24号菌种(厚朴内生真菌)于4°C冰箱冷藏。
实验试剂
厚朴酚对照品(购自Chengdu PurChemStandard Co,Ltd.批号：140823)
葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、硝酸铵、硝酸钠、草酸铵、甲醇、乙酸乙酯，以上试剂均为分析纯。
琼脂粉、蔗糖、玉米粉、小麦粉、β环糊精、淀粉、蛋白胨、酵母浸粉、赤霉素、矮壮素、维生素C、维生素B1。
目 录
1 文献综述 1
1.1 厚朴的简介 1
1.2 厚朴的化学成分 1
1.2.1 酚类 1
1.2.2 生物碱类 1
1.2.3 挥发油类 1
1.2.4 其他 1
1.3 植物内生真菌 2
1.4 发酵培养的C源及N源 2
2 实验部分 4
2.1 实验材料 4
2.1.1 菌种 4
2.1.2 实验试剂 4
2.1.3 实验设备 4
2.1.4 培养基及主要溶液的配制 4
2.2 实验方法 4
2.2.1 单因素实验 5
2.2.2 标准曲线的建立 6
2.2.3 响应面法 6
2.3 实验结果 6
2.3.1 对照品与空白的测定 6
2.3.2 单因素测定结果 10
2.3.3 HPLC测定结果 12
2.3.4 响应面测定结果 12
2.4 讨论 17
2.4.1 单因素实验分析 18
2.4.2 响应面法分析 18
结论 20
参考文献 21
致谢 2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
3
文献综述
厚朴的简介
厚朴是我国特有的珍贵树种之一[1]，它的树皮、根皮、花、种子及芽皆可入药[2]，厚朴性温，味苦辛[3]。主要成分厚朴酚、和厚朴酚[4]，存在的药用价值还都很高。厚朴中药材在临床上使用较为广泛，以厚朴为配方的中成药就多达二百多种[5]。
由于市场对厚朴的需求日益增加，但是厚朴生长缓慢、供应不足[6]，虽然国内以及部分地区大面积、大规模的种植，但从长远来看，远远不能满足生产所需[7]。通过开发新的研究方法，进一步提高厚朴的资源利用率。
厚朴的化学成分
酚类
厚朴中含有多种酚类物质，在厚朴的活性成分中占有5%[8]的比例，其中主要的活性物质以厚朴酚、和厚朴酚为主，还含有四氢厚朴酚、以厚朴酚、龙脑基厚朴酚、辣薄荷基厚朴酚、厚朴木质素AI、厚朴三醇、厚朴醛BE、台湾檫木醛、2,2二羟基5烯丙基连苯5丙烯醛、丁香脂素、2,2,5三羟基5烯丙基连二苯、8,9二羟基二氢和厚朴酚、8,9二羟基7甲氧基二氢和厚朴酚等[9]。
生物碱类
厚朴中含有的生物碱类成分以厚朴碱为主，还存在木兰花碱(Magnoflorine)、武当木兰花碱(Magnosprengerine)、白兰花碱(Michelalbine)、木兰箭毒碱(Magnocurarine)、氧化黄心树宁碱、N降荷叶碱、番荔枝碱、鹅掌楸碱、罗默碱、瑞枯灵及阿朴啡生物碱类化合物等[10]。
挥发油类
厚朴中含有的挥发油存在多种化学成分，有α蒎烯、β蒎烯、D柠檬烯、樟烯等[11]，其中大多数为有效成分。经气相色谱质谱联用仪(GCMS)鉴定出48种化合物，其中以桉叶醇以及其异构体异桉叶醇的含量最高[12]。
其它
厚朴中可以分离得到芦丁、棕榈酮、榔皮苷、花生酸、二十六烷醇、胡萝卜
苷[13]。从厚朴中还可以分离得到1(4羟基3甲氧基苯基)2[4(w羟丙基)2甲氧基苯氧基]1,3苯二醇[14]。
植物内生真菌
人们对于植物内生真菌(Plantendophyticfungi)已经有了上百年的研究经验。关于对内生真菌的研究，人们起初是源于对黑麦草等牧草上产生的生物碱类毒素的内生真菌引起的家畜病毒，直到20世纪80年代依然还是很少有涉及到这个领域的研究[15]。1993年，美国蒙拿大大学植物病理学系Stierle研究小组从药用植物太平洋红豆杉树皮中仅分离得到了一株具有合成与宿主细胞相同的抗癌药物(紫杉醇的内生真菌) [16]。
目前，内生真菌代谢产物能够产生与宿主相同或相似的代谢产物，但发酵产物的含量均较低，不能够满足工业需求。大多研究者都投身于对内生真菌发酵培养进行研究。
发酵培养的C源及N源
对于真菌来说，最主要的营养物质为C源、N源、生长因子。对于真菌来说，C源可提供物质、能量；N源影响繁殖、休眠(死亡)；生长因子可提供所需的微量元素。调查发现大部分研究者都以C源、N源、生长因子作为研究对象，研究植物内生真菌的发酵影响。
马思佳等[17]通过对培养基中不同C源的选择来对活性污泥微生物细胞膜特性和菌落结构进行研究影响。试验结果表明：不同的C源会影响微生物合成的磷脂脂肪酸(PLFA)。最终实验结果得到：蛋白胨可以作为最佳C源来让活性污泥生物菌落结构多样性增加的。
林壁润等[18]通过对万隆霉素产生菌发酵培养所需的C源、N源试验。试验显示：抗万隆霉素筛选出的C源为糊精、大米粉。筛选出的N源为酵母膏、玉米浆。
宾冬梅等[19]在啤酒糟培养基中加入不同的C源、N源，并且适当的改变它的比例。试验显示：C源：6%乳糖；N源：4%胰蛋白胨。
罗玮等[20]以培养基的C源、N源等我研究对象进行试验。通过单因素、正交设计的方法去筛选出各物质比例。试验显示：最佳C源为玉米粉；最佳N源为黄豆粉。
关于厚朴内生真菌代谢产物发酵培养条件的优化相关研究文献较少，过去大家大多都是对紫杉醇，鱼腥草等一些植物进行了研究。综上所述，发现内生真菌厚朴酚的研究报道相对较少，因此本文对厚朴内生真菌的发酵所需的条件进行了优化。本文拟选用的C源有蔗糖、玉米粉、小麦粉、β环糊精、淀粉；拟选用的N源有蛋白胨、硝酸铵、硝酸钠、酵母浸粉、草酸铵；拟选用的生长因子有赤霉素、矮壮素、维生素C、维生素B1。
本文主要用响应面的方法来对厚朴内生真菌所需的营养物质(C源，N源及生长因子)的含量进行研究。并通过使用HPLC法测定厚朴酚的含量作为依据，从而优化得到了厚朴内生真菌发酵培养的C源、N源及生长因子的比例，为实际生产提供一个有利的依据。
实验部分
实验材料
菌种
陕西国际商贸学院5#502微生物实验室：YX24号菌种(厚朴内生真菌)于4°C冰箱冷藏。
实验试剂
厚朴酚对照品(购自Chengdu PurChemStandard Co,Ltd.批号：140823)
葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、硝酸铵、硝酸钠、草酸铵、甲醇、乙酸乙酯，以上试剂均为分析纯。
琼脂粉、蔗糖、玉米粉、小麦粉、β环糊精、淀粉、蛋白胨、酵母浸粉、赤霉素、矮壮素、维生素C、维生素B1。
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