同一个体鲤鱼肝肾肌肉组织线粒体异质性的比较
1基于细胞色素B基因，利用直接测序技术，我们比较了鲤鱼一个一龄个体肝脏、肾脏和肌肉三个组织的线粒体异质性。结果发现肌肉组织野生型比例最低为54%，肝脏为野生型比例为59%，肾脏最高为68%。说明肌肉组织容易积累突变而降低线粒体的活性。点突变中G替代A最多，其次是C替代T，这两个替代突变占总点突变比例的65.9%；T替代A、T替代C、A替代T、A替代G属于低频率替代突变，占24.2%；缺失和插入突变比较少比例为4.5%； A替代C、G替代C、C替代G、T替代G、G替代T属于稀有替代突变，占5.4%。本研究发现鲤鱼同一个个体不同组织之间、同一个组织之间线粒体都存在广泛的异质性，不同组织异质性有一定差异。
目录
引言
引言线粒体是鱼类细胞的重要细胞器，是能量生成场所，通过氧化磷酸化为有机体提供90％ 的ATP能源。除此之外在细胞凋亡和死亡中也发挥重要作用。因此在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义。关于线粒体的研究，现在多集中于利用线粒体的一些基因如（16S rRNA、COI基因、细胞色素B等）基因片段对鱼类的不同种群，不同群体或不同种属之间系统发育关系进行研究（Dong et al. 2012; Cheng et al. 2012; Zhang et al, 2012; Guo et al, 2005）。
线粒体DNA是裸露的环性分子，缺乏组蛋白的保护，而且由于呼吸链经常产生活性氧类物质对线粒体DNA也有一定的突变效应，所以线粒体具有较高的突变率和序列的多样性。mtDNA异质性一般指同一细胞或同一个体内存在着两个不同mtDNA亚群，它包括点异质型和长度异质。在利用线粒体进行系统发育分析时，这些差异往往被忽视。吕国庆等认为鱼类线粒体大部分是同质性，异质性很低（Lu, 1998）。这一观点现在在鱼类线粒体研究中被广泛认可，所以很多有关鱼类异质性的报道都误解为不同个体或群体之间线粒体序列之间的差异。但是Beata Kmiec认为线粒体异质性广泛在于动植物种（Kmiec, 2006），尤其有关线粒体异质性和人类疾病的关联研究中有很多报道。线粒体某些位点的突变（无论大片段的重排还是单碱基替代）都和人类疾病的相关联，由于一个线粒体内，mtDNA的多拷贝性，其致病性要达到一定的阀值 （Tay *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
lor & Turnbull, 2005）。线粒体中研究最广泛的一个突变是编码tRNA（Leu）基因的一个二氢尿嘧啶核苷环在3243位点出一个A置换G的突变，其导致了线粒体脑肌病的MELAS亚群，其引发的原因就是该突变在骨骼肌线粒体的异质性分布和它在线粒体中所占的比例达到一定的阀值（Goto & Horai, 1990; Greaves & Taylor, 2006; Chinnery et al.. 1997）。
由于鱼类对于线粒体异质性研究还是一个空白，我们对于鲤鱼同一个体是否存在的线粒体异质性，以及差异大小并不知晓，所以本研究利用细胞色素B部分序列对鲤鱼同一个体不同组织的异质性进行了研究，为今后研究鱼类线粒体异质性对鱼类生理疾病、衰老、退化等方面的应用提供一个基础知识。
1 材料与方法
1.1 材料来源
2012年11月采样，鲤鱼来自中国水产科学院淡水渔业研究中心渔种场，为一龄建鲤。DNA提取样品来自肌肉、肝脏和肾脏。
1.2 基因组DNA提取
取三个组织样品各约0.1g，加入450μl STE（150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris，1mmol/L EDTA）缓冲液，12.5μl的10% SDS，10μl蛋白酶K（20mg/ml）混匀，55℃消化过夜，用苯酚、氯仿各抽提一次，等体积的异丙醇沉淀，12000r/min离心30 min，沉淀用70%的乙醇洗2次，再用30μl双蒸水溶解，在0.8%的琼脂糖凝胶上检测DNA的质量和浓度。
1.3 细胞色数B序列扩增
为了确保扩增序列的正确性，本研究使用的是Pfu DNA聚合酶。引物序列：5′gacttgaaaaaccaccgttg3′；5′cctcagaaggatatttgtcctc3′。扩增反应总体积为25μl，包括1.0 μl模板，2.5 μl10×PCR buffer，10pmol primer，1.5μl dNTPs （2.5 mmol），2 U Pfu DNA聚合酶，加水至25 μl。 扩增反应的程序为：首先进行94℃变性2min； 然后94℃变性 30 s，55℃复性45 s，72℃延伸1 min 30 s，反应进行35个循环，最后72℃延伸10 min。在1.0%的琼脂糖凝胶上检测扩增产物。
1.4 克隆测序
由于Pfu DNA聚合酶产物无法和T载体连接，我们使用普通Taq酶进行加尾。反应体系为10μl，包含扩增产物7μl，1μl10×PCR buffer，5 U Taq酶，0.2mM dATP。70℃温育30 min。然后和T载体连接。每个样品挑100个克隆，酶切确定有插入片段后测序。
1.5 序列分析
得到的序列去掉载体序列，转化为FASTA格式，用Bioedit软件分析，无法比对的结果在NCBI网站用Blast软件寻找相近序列。用Bioedit寻找合意序列（野生型序列），和合意序列不相同的为变异序列。
2结果
2.1 测序结果和合意序列（野生型）
本研究每个样品测序100 条，每条平均长度为468bp，三个样品总共测序长度140400bp，变异位点（一个位点在两条序列检测到突变算两个突变位点）129个，占总序列的约0.0009。图1是该序列的合意序列，即野生型序列。
Fig.1细胞色素合意序列（野生型）
2.2变异序列比例的比较
表1 肌肉、肝脏和肾脏变异序列比较
Tab 1. Comparison of mutative sequences among muscle, liver and kidney
大片段突变序列
Ratio of Large fragment mutation
点突变比例
Ratio of point mutation
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引言
引言线粒体是鱼类细胞的重要细胞器，是能量生成场所，通过氧化磷酸化为有机体提供90％ 的ATP能源。除此之外在细胞凋亡和死亡中也发挥重要作用。因此在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义。关于线粒体的研究，现在多集中于利用线粒体的一些基因如（16S rRNA、COI基因、细胞色素B等）基因片段对鱼类的不同种群，不同群体或不同种属之间系统发育关系进行研究（Dong et al. 2012; Cheng et al. 2012; Zhang et al, 2012; Guo et al, 2005）。
线粒体DNA是裸露的环性分子，缺乏组蛋白的保护，而且由于呼吸链经常产生活性氧类物质对线粒体DNA也有一定的突变效应，所以线粒体具有较高的突变率和序列的多样性。mtDNA异质性一般指同一细胞或同一个体内存在着两个不同mtDNA亚群，它包括点异质型和长度异质。在利用线粒体进行系统发育分析时，这些差异往往被忽视。吕国庆等认为鱼类线粒体大部分是同质性，异质性很低（Lu, 1998）。这一观点现在在鱼类线粒体研究中被广泛认可，所以很多有关鱼类异质性的报道都误解为不同个体或群体之间线粒体序列之间的差异。但是Beata Kmiec认为线粒体异质性广泛在于动植物种（Kmiec, 2006），尤其有关线粒体异质性和人类疾病的关联研究中有很多报道。线粒体某些位点的突变（无论大片段的重排还是单碱基替代）都和人类疾病的相关联，由于一个线粒体内，mtDNA的多拷贝性，其致病性要达到一定的阀值 （Tay *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
lor & Turnbull, 2005）。线粒体中研究最广泛的一个突变是编码tRNA（Leu）基因的一个二氢尿嘧啶核苷环在3243位点出一个A置换G的突变，其导致了线粒体脑肌病的MELAS亚群，其引发的原因就是该突变在骨骼肌线粒体的异质性分布和它在线粒体中所占的比例达到一定的阀值（Goto & Horai, 1990; Greaves & Taylor, 2006; Chinnery et al.. 1997）。
由于鱼类对于线粒体异质性研究还是一个空白，我们对于鲤鱼同一个体是否存在的线粒体异质性，以及差异大小并不知晓，所以本研究利用细胞色素B部分序列对鲤鱼同一个体不同组织的异质性进行了研究，为今后研究鱼类线粒体异质性对鱼类生理疾病、衰老、退化等方面的应用提供一个基础知识。
1 材料与方法
1.1 材料来源
2012年11月采样，鲤鱼来自中国水产科学院淡水渔业研究中心渔种场，为一龄建鲤。DNA提取样品来自肌肉、肝脏和肾脏。
1.2 基因组DNA提取
取三个组织样品各约0.1g，加入450μl STE（150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris，1mmol/L EDTA）缓冲液，12.5μl的10% SDS，10μl蛋白酶K（20mg/ml）混匀，55℃消化过夜，用苯酚、氯仿各抽提一次，等体积的异丙醇沉淀，12000r/min离心30 min，沉淀用70%的乙醇洗2次，再用30μl双蒸水溶解，在0.8%的琼脂糖凝胶上检测DNA的质量和浓度。
1.3 细胞色数B序列扩增
为了确保扩增序列的正确性，本研究使用的是Pfu DNA聚合酶。引物序列：5′gacttgaaaaaccaccgttg3′；5′cctcagaaggatatttgtcctc3′。扩增反应总体积为25μl，包括1.0 μl模板，2.5 μl10×PCR buffer，10pmol primer，1.5μl dNTPs （2.5 mmol），2 U Pfu DNA聚合酶，加水至25 μl。 扩增反应的程序为：首先进行94℃变性2min； 然后94℃变性 30 s，55℃复性45 s，72℃延伸1 min 30 s，反应进行35个循环，最后72℃延伸10 min。在1.0%的琼脂糖凝胶上检测扩增产物。
1.4 克隆测序
由于Pfu DNA聚合酶产物无法和T载体连接，我们使用普通Taq酶进行加尾。反应体系为10μl，包含扩增产物7μl，1μl10×PCR buffer，5 U Taq酶，0.2mM dATP。70℃温育30 min。然后和T载体连接。每个样品挑100个克隆，酶切确定有插入片段后测序。
1.5 序列分析
得到的序列去掉载体序列，转化为FASTA格式，用Bioedit软件分析，无法比对的结果在NCBI网站用Blast软件寻找相近序列。用Bioedit寻找合意序列（野生型序列），和合意序列不相同的为变异序列。
2结果
2.1 测序结果和合意序列（野生型）
本研究每个样品测序100 条，每条平均长度为468bp，三个样品总共测序长度140400bp，变异位点（一个位点在两条序列检测到突变算两个突变位点）129个，占总序列的约0.0009。图1是该序列的合意序列，即野生型序列。
Fig.1细胞色素合意序列（野生型）
2.2变异序列比例的比较
表1 肌肉、肝脏和肾脏变异序列比较
Tab 1. Comparison of mutative sequences among muscle, liver and kidney
大片段突变序列
Ratio of Large fragment mutation
点突变比例
Ratio of point mutation
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