长江刀鲚微卫星亲子鉴定技术研究
DNA亲子鉴定是目前鉴定亲缘关系的主要手段，在一定程度上显示着较强的优势。本实验以人工养殖的长江刀鲚为实验对象，以微卫星监测方式对长江刀鲚的亲本及子代进行亲缘关系的检测,从而判定其亲子关系。本实验从刀鲚全基因组数据中筛选10个微卫星位点，并设计了10对微卫星引物。通过PCR扩增和琼脂糖电泳检测，筛选出4对特异性及多态性良好的引物。再对筛选出的四对引物进行荧光标记及毛细管电泳检测，最终获得2对符合亲子鉴定的条件引物用于本次实验。本实验首次采用微卫星标记技术来建立刀鲚的亲子鉴定技术体系，不仅可以突破刀鲚遗传家系建立的限制，还可以用于研究刀鲚产卵规律的研究，具有重要的应用价值。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 实验材料及器材3
1.1.1 实验材料 3
1.1.2 实验器材3
1.1.3 实验内容3
1.2 实验步骤3
1.2.1 DNA提取3
1.2.2 基因组DNA质量及浓度4
1.2.3 微卫星引物4
1.2.4 PCR扩增 5
1.2.5 ABI3730检测微卫星基因型5
2 结果 5
2.1 基因组提取 5
2.2 引物筛选 5
2.2.1琼脂糖电泳图 5
2.2.2 ABI3730测序仪测序 6
3 讨论7
致谢8
参考文献8
图1 基因组琼脂糖凝胶电泳5
图2 PCR扩增的电泳成像6
图3 荧光检测图谱7
表1 微卫星引物详情4
长江刀鲚微卫星亲子鉴定技术研究
引言
家系选育是获得优良品种的重要手段之一，其可以增加物种某一种群体内具有育种价值的基因频率，降低育种不需要的基因频率，使个体更适用于特定的生产目的和要求[3]。在家系选育过程中，准确地掌握系谱信息，可以有效地指导亲本选留，从而缩短育种周期，提高育种效率。然而，刀鲚应激反应强烈，限制了其一 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
对一构建遗传家系，严重制约了刀鲚遗传育种工作的开展，同时环境因素对遗传参数有较大的影响，因此，为了降低环境因素对遗传参数的准确评估，需要利用遗传标记对混养的不同家系进行亲子鉴定[4]。
亲子鉴定，是以子代与亲代的外部形态或生理机能等方面相似的特点作为依据，利用生物学、遗传学以及法医学的理论与技术，对子代与亲代的遗传特征进行分析，从而判断父母与子女之间的亲缘关系。在我国，古代时期就已存在亲子鉴定的历史，如早期的滴血验亲等。简单来说，亲子鉴定就是通过对血型或DNA的检测对父母与子女之间的亲缘关系进行鉴定。
在种质资源的研究和育种工作中，作为基因型的易于识别的表现形式，遗传标记有着十分重要的地位。而DNA分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是在DNA水平上遗传变异的直接反映[5]。DNA分子标记的标记数量丰富，且不受环境和发育阶段的影响，使杂交育种的有效性和可靠性显著提高，而且在对杂种机理的认识、杂种优势的预测、目的性状的选择等方面已显示出不可比拟的优越性[6]。近年来DNA分子标记技术不断发展，具有代表性的主要有以下几种：限制性片段长度多态性RFLP、随机扩增多态性DNA标记RAPD、扩增片段长度多态技术AFLP、单核苷酸多态性SNP和微卫星DNA标记技术SSR。以上几种标记的原理主要基于不同个体的基因组碱基差异，通过内切酶位点、PCR扩增等技术来识别这些差异的等位基因，以达到区分的目的。
从目前的研究情况来看，微卫星标记在亲子鉴定中的应用比较广泛。微卫星是指重复单位为2～6个核苷酸的多次串联的非编码DNA重复序列，这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，含量十分丰富，且呈随机均匀分布[7]。SSR是根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。因其核心序列的重复数目有所不同，所以可以扩增出不同长度的PCR产物，能更加有效的检测DNA多态性。相比较其他几种分子标记，微卫星在目前的分子标记应用上优势较为明显。
首先其分布广泛，根据Weber等[8]、Beckman等[9]的研究表明，真核生物中大约每10~50kb或每6kb就存在一个微卫星序列，而且其具有高度多态性，可以高效率地区分亲子关系较近的群体；其次其通用性高，对DNA样品没有较高的质量要求，且微卫星序列可以公开发表，有利于数据的共享；最后，此种标记技术稳定性高，扩增反应所需模板量少、重复性好，能在一定程度上保证PCR扩增的稳定性与高效性。所以微卫星标记技术在亲子鉴定与生物遗传多态性的研究中正在逐步取代其他分子标记技术。
目前国内外的科研工作者已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠及几个植物物种的染色体遗传图谱，并将微卫星标记广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析[10]等方面。在家畜的亲子鉴定中，Fredholm等[11]用69个多态性较好的微卫星位点，对15窝来自12个不同品种的狗进行检测，并且在准确率为99.99%的标准下，利用微卫星标记确认了一个存在争议的母本。GLuikart等[12]利用22个微卫星位点，在准确率大于99.99%的标准下，成功对克什米尔羊、蒙古羊、安哥拉羊群进行了亲子鉴定。
在现阶段，微卫星标记技术在检测鱼类亲缘关系的应用上面也相当广泛。辛苗苗等[13]通过对中华鲟的研究，以0.99的排除率作为标准，成功筛选出7对符合要求的微卫星位点，并以此7对微卫星标记作为建立中华鲟亲子鉴定体系的核心体系，并为该体系的高效准确发展提供依据。任昆等[14]检测5个草鱼家系的亲本及其子代的基因型，发现以93.71%的鉴定率和95%的置信度为标准，采用四个微卫星引物标记，即可在有50个未知性别亲本的情况下做亲子鉴定，满足多数的家系同塘繁育的实验需求。葛会争[15]等采用8个微卫星标记对黑龙江野鲤与德国镜鲤的正反交结果进行亲子鉴定，结果表明，正反交组分别利用6和8个多态性良好的引物就能正确鉴定。张春雷[3]等利用7微卫星标记对哲罗鱼的不同群体进行了亲子鉴定，发现微卫星标记可用于对哲罗鱼进行家系鉴定分析，并发现亲子鉴定的能力与准确率对着群体的增大而逐渐减小。在冯俊伟[16]对长江江豚的研究中，在幼鱼样本母本确定的情况下，利用8个具有高度多态性的微卫星位点，成功确认两个群体中所有幼鱼的父本。
本研究以中国水产科学研究院淡水渔业研究中心繁育的F2刀鲚个体为研究对象，采用微卫星标记检测的方法，建立其亲子鉴定技术体系，对多对亲本随机交配后的群体混养家系进行亲缘关系鉴定。旨在突破长江刀鲚一对一遗传家系建立的限制，提供生长速度快且抗病力强的候选亲本并利用分子标记来辅助支撑育种技术；同时本实验可用于长江刀鲚交配产卵规律的研究，具有十分重要的应用价值。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 实验材料及器材3
1.1.1 实验材料 3
1.1.2 实验器材3
1.1.3 实验内容3
1.2 实验步骤3
1.2.1 DNA提取3
1.2.2 基因组DNA质量及浓度4
1.2.3 微卫星引物4
1.2.4 PCR扩增 5
1.2.5 ABI3730检测微卫星基因型5
2 结果 5
2.1 基因组提取 5
2.2 引物筛选 5
2.2.1琼脂糖电泳图 5
2.2.2 ABI3730测序仪测序 6
3 讨论7
致谢8
参考文献8
图1 基因组琼脂糖凝胶电泳5
图2 PCR扩增的电泳成像6
图3 荧光检测图谱7
表1 微卫星引物详情4
长江刀鲚微卫星亲子鉴定技术研究
引言
家系选育是获得优良品种的重要手段之一，其可以增加物种某一种群体内具有育种价值的基因频率，降低育种不需要的基因频率，使个体更适用于特定的生产目的和要求[3]。在家系选育过程中，准确地掌握系谱信息，可以有效地指导亲本选留，从而缩短育种周期，提高育种效率。然而，刀鲚应激反应强烈，限制了其一 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
对一构建遗传家系，严重制约了刀鲚遗传育种工作的开展，同时环境因素对遗传参数有较大的影响，因此，为了降低环境因素对遗传参数的准确评估，需要利用遗传标记对混养的不同家系进行亲子鉴定[4]。
亲子鉴定，是以子代与亲代的外部形态或生理机能等方面相似的特点作为依据，利用生物学、遗传学以及法医学的理论与技术，对子代与亲代的遗传特征进行分析，从而判断父母与子女之间的亲缘关系。在我国，古代时期就已存在亲子鉴定的历史，如早期的滴血验亲等。简单来说，亲子鉴定就是通过对血型或DNA的检测对父母与子女之间的亲缘关系进行鉴定。
在种质资源的研究和育种工作中，作为基因型的易于识别的表现形式，遗传标记有着十分重要的地位。而DNA分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是在DNA水平上遗传变异的直接反映[5]。DNA分子标记的标记数量丰富，且不受环境和发育阶段的影响，使杂交育种的有效性和可靠性显著提高，而且在对杂种机理的认识、杂种优势的预测、目的性状的选择等方面已显示出不可比拟的优越性[6]。近年来DNA分子标记技术不断发展，具有代表性的主要有以下几种：限制性片段长度多态性RFLP、随机扩增多态性DNA标记RAPD、扩增片段长度多态技术AFLP、单核苷酸多态性SNP和微卫星DNA标记技术SSR。以上几种标记的原理主要基于不同个体的基因组碱基差异，通过内切酶位点、PCR扩增等技术来识别这些差异的等位基因，以达到区分的目的。
从目前的研究情况来看，微卫星标记在亲子鉴定中的应用比较广泛。微卫星是指重复单位为2～6个核苷酸的多次串联的非编码DNA重复序列，这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，含量十分丰富，且呈随机均匀分布[7]。SSR是根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。因其核心序列的重复数目有所不同，所以可以扩增出不同长度的PCR产物，能更加有效的检测DNA多态性。相比较其他几种分子标记，微卫星在目前的分子标记应用上优势较为明显。
首先其分布广泛，根据Weber等[8]、Beckman等[9]的研究表明，真核生物中大约每10~50kb或每6kb就存在一个微卫星序列，而且其具有高度多态性，可以高效率地区分亲子关系较近的群体；其次其通用性高，对DNA样品没有较高的质量要求，且微卫星序列可以公开发表，有利于数据的共享；最后，此种标记技术稳定性高，扩增反应所需模板量少、重复性好，能在一定程度上保证PCR扩增的稳定性与高效性。所以微卫星标记技术在亲子鉴定与生物遗传多态性的研究中正在逐步取代其他分子标记技术。
目前国内外的科研工作者已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠及几个植物物种的染色体遗传图谱，并将微卫星标记广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析[10]等方面。在家畜的亲子鉴定中，Fredholm等[11]用69个多态性较好的微卫星位点，对15窝来自12个不同品种的狗进行检测，并且在准确率为99.99%的标准下，利用微卫星标记确认了一个存在争议的母本。GLuikart等[12]利用22个微卫星位点，在准确率大于99.99%的标准下，成功对克什米尔羊、蒙古羊、安哥拉羊群进行了亲子鉴定。
在现阶段，微卫星标记技术在检测鱼类亲缘关系的应用上面也相当广泛。辛苗苗等[13]通过对中华鲟的研究，以0.99的排除率作为标准，成功筛选出7对符合要求的微卫星位点，并以此7对微卫星标记作为建立中华鲟亲子鉴定体系的核心体系，并为该体系的高效准确发展提供依据。任昆等[14]检测5个草鱼家系的亲本及其子代的基因型，发现以93.71%的鉴定率和95%的置信度为标准，采用四个微卫星引物标记，即可在有50个未知性别亲本的情况下做亲子鉴定，满足多数的家系同塘繁育的实验需求。葛会争[15]等采用8个微卫星标记对黑龙江野鲤与德国镜鲤的正反交结果进行亲子鉴定，结果表明，正反交组分别利用6和8个多态性良好的引物就能正确鉴定。张春雷[3]等利用7微卫星标记对哲罗鱼的不同群体进行了亲子鉴定，发现微卫星标记可用于对哲罗鱼进行家系鉴定分析，并发现亲子鉴定的能力与准确率对着群体的增大而逐渐减小。在冯俊伟[16]对长江江豚的研究中，在幼鱼样本母本确定的情况下，利用8个具有高度多态性的微卫星位点，成功确认两个群体中所有幼鱼的父本。
本研究以中国水产科学研究院淡水渔业研究中心繁育的F2刀鲚个体为研究对象，采用微卫星标记检测的方法，建立其亲子鉴定技术体系，对多对亲本随机交配后的群体混养家系进行亲缘关系鉴定。旨在突破长江刀鲚一对一遗传家系建立的限制，提供生长速度快且抗病力强的候选亲本并利用分子标记来辅助支撑育种技术；同时本实验可用于长江刀鲚交配产卵规律的研究，具有十分重要的应用价值。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/scyz/40.html
