tnfα单核苷酸位点多态性与tnfα阻断剂的药物基因组学研究
肿瘤坏死因子α（TNF-α）是自身免疫性疾病的关键致病因子，TNF-α拮抗剂可有效治疗强直性脊柱炎（AS）、类风湿关节炎（RA）、炎性肠性疾病（IBD）及银屑病（PsA）等自身免疫病，但价格昂贵，且20％～45％的患者使用后无效或疗效不佳，因此本课题拟研究针对中国汉族人群患者TNF-α拮抗剂的药效相关的TNF-α启动子变异。本课题组已选取符合1984年修订的纽约标准的74例依那西普治疗的AS患者入组，对四个SNP位点（TNF-α -238、TNF-α -308、TNF-α -857、TNF-α -1031）进行SNP基因分型分析，并在患者使用药物12周后进行药效评判。结果显示TNF-α -238位点、TNF-α -308位点、TNF-α -857位点均不能有效预测AS患者服用TNF-α拮抗剂后的药效， 但在TNF-α -1031位点BASDAI评分下，在显性模型（P=0.074＜0.1）与超显性模型（p=0.036＜0.05）中均能准确地预测AS患者使用TNF-α拮抗剂后的药效。表明在汉族人群中，TNF-α -238、TNF-α -308及TNF-α -857位点的多态性与TNF-α拮抗剂药效反应无关，TNF-α -1031位点携带有C等位基因的患者使用TNF-α拮抗剂后具有更好的疗效。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言5
1 材料与方法5
1.1 研究对象 5
1.1.1 病例选择标准5
1.1.2 病例排除标准6
1.2 药物试验方法及各项指标6
1.2.1 药物用法6
1.2.2 临床观察指标及治疗反应性评价指标6
1.3 实验材料6
1.3.1 人外周白细胞DNA提取试剂6
1.3.2 PCR扩增试剂6
1.3.3 琼脂糖凝胶电泳试剂6
1.3.4 实验仪器6
1.4 实验方法7
1.4.1 人外周全血DNA的提取7
1.4.2 基因PCR扩增与检测7
1.4.2.1 PCR引物设计7
1.4.2.2 PCR *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
反应体系和条件7
1.4.2.3 检测PCR产物的特异性和浓度7
1.4.3 基因分型 8
1.5 TNFα基因SNPs的选择8
1.6 统计学处理8
2 结果与分析8
2.1 TNFα位点 PCR分型结果8
2.2 患者的一般情况及基线疾病特点和试验完成情况9
2.3 AS患者TNFα上游位点基因多态性对依那西普治疗的影响9
2.3.1 TNFα 238位点基因多态性对依那西普治疗后BASDAI及ASAS评分的影响9
2.3.2 TNFα 308位点基因多态性对依那西普治疗后BASDAI及ASAS评分的影响9
2.3.3 TNFα 857位点基因多态性对依那西普治疗后BASDAI及ASAS评分的影响9
2.3.4 TNFα 1031位点基因多态性对依那西普治疗后BASDAI及ASAS评分的影响10
3 讨论11
3.1 依那西普的治疗效果11
3.2 TNFα各位点基因多态性对依那西普治疗AS的影响12
致谢13
参考文献14
TNFα单核苷酸位点多态性与TNFα拮抗剂的药物基因组学研究
引言
强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis，AS）是一种以中轴关节病变为主，并可累及外周关节及内脏和其他组织的慢性自身免疫疾病。临床上以骶髂关节炎、肌腱端炎和脊柱炎为特点，严重时导致患者躯体功能丧失和残疾。AS在青壮年男性中发病率较高，平均发病年龄为26岁左右，全世界男女发病率的比例大约为2:1左右[1]，在中国，AS的患病率约为0.3%。AS是一种高患病率、高致残率，并会长期影响患者生活质量的疾病，也是临床分类诊断明确的多基因遗传病。
全基因组扫描、连锁和关联分析（GWAS）结果提示：除MHCⅠ类抗原HLAB27基因与AS强相关以外，在不同种族和不同地区的人群中也有不同的非HLAB27基因显示与AS相关[2,3]。目前在已发表的GWAS中，已总结得出非MHC（Major Histocompability Complex）区域中25个与AS相关的位点，主要在抗原呈递通路、IL23R信号通路以及TNF受体信号通路中起作用[47]。目前与AS发病研究较为深入的是白介素（interleukin，IL）家族，包括IL1、IL10、IL6等基因的多态性与AS的发病都有一定关系。Davidson等[4]对527名中国汉族AS患者和954名健康者进行SNP分型时发现，ERAP1（endoplasmic reticulum aminopeptidase1, ERAPl）在中国汉族人群以及高加索人群中与AS的发病均存在关联，而IL23R在中国人群中则与AS发病无关，这与高加索人群验证的结果不同，证明不同人群之间存在差异[7]。但以上关联分析存在局限性，这些非MHC区域基因仅仅可以解释少于25%的遗传因素，仍有近乎75%的未知区域有待解释，不排除罕见突变与拷贝数变异的可能性[8]，因此，对于未知区域，仍有待于进一步的研究。在MHC区域中，TNFα（Tumor Necrosis Factor, TNF）是与AS关联的重要基因[9]。TNFα基因定位于6号染色体短臂Ⅲ类MHC区域，与MHCⅠ类基因抗原HLAB27基因位置相近，已有大量研究证明，TNFα是AS易感基因之一[1,1013]。在TNFα基因序列中，其上游启动区具有调控TNFα转录和表达的作用，该区域有众多位点存在单核苷酸多态性。有研究表明这种多态性可以影响TNFα的转录和表达，从而导致体内TNFα水平的不同，进而影响疾病的发展[14,15]。
治疗AS的传统方法有多种，然而不同的治疗方法在不同个体之间的治疗效果差异显著[1618]。以TNFα为靶标的TNFα拮抗剂是治疗AS的生物制剂中应用最为广泛的一种，近年来的研究均显示其对患者的疾病活动度、患者的躯体功能和生活质量有明显改善[12,1921]。研究表明[9,22,23]，不同的位点多态性基因型风湿性疾病患者对TNFα拮抗剂治疗的疗效不同，提示这些位点不同的基因型可以作为预测治疗疗效的工具。药物基因组学研究表明基因多态性可能对药物代谢产生影响，也可能影响药物靶标或药物受体从而影响个体对药物的反应[24]。依那西普以TNFα为靶标，通过结合外周可溶性TNFα，阻止其与细胞膜上的受体进一步结合而发挥作用，因此可能更易受到TNFα基因多态性的影响。TNFα是AS的发病过程中的重要致炎因子，它的启动子区域基因多态性又可以影响TNFα水平，因此可以推测TNFα部分位点基因多态性与TNFα拮抗剂治疗的疗效之间可能存在某些联系[25,26]，目前在汉族人群中，TNFα位点基因多态性对依那西普治疗AS的疗效影响尚缺乏足够资料。因此，本课题拟研究并明确患者TNFα及其受体基因单核苷酸位点多态性与患者对TNFα拮抗剂的药效之间的关系，探讨基因多态性与靶向治疗的疗效的关联。在此之后，我们可以根据患者的基因型差异，建立个性化的治疗方案，指导患者用药，从而实现精准化医疗，为患者抓住宝贵的治疗时机，并减轻患者的经济负担，减轻药物副作用，对患者健康带来的影响。
1 材料与方法
1．1 研究对象
1．1．1 病例选择标准 2015年7月2016年2月，在上海光华医院以及上海长海医院风湿免疫科接受治疗的强直性脊柱炎患者。所有患者均符合1984年修订的纽约标准[27,28]，要求患者年龄2065岁，中国汉族人群，能够完全理解并正确填写有关问卷，入选前三个月内无服用激素及其他免疫抑制药物治疗史。共入选74例患者，均签署知情同意书。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言5
1 材料与方法5
1.1 研究对象 5
1.1.1 病例选择标准5
1.1.2 病例排除标准6
1.2 药物试验方法及各项指标6
1.2.1 药物用法6
1.2.2 临床观察指标及治疗反应性评价指标6
1.3 实验材料6
1.3.1 人外周白细胞DNA提取试剂6
1.3.2 PCR扩增试剂6
1.3.3 琼脂糖凝胶电泳试剂6
1.3.4 实验仪器6
1.4 实验方法7
1.4.1 人外周全血DNA的提取7
1.4.2 基因PCR扩增与检测7
1.4.2.1 PCR引物设计7
1.4.2.2 PCR *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
反应体系和条件7
1.4.2.3 检测PCR产物的特异性和浓度7
1.4.3 基因分型 8
1.5 TNFα基因SNPs的选择8
1.6 统计学处理8
2 结果与分析8
2.1 TNFα位点 PCR分型结果8
2.2 患者的一般情况及基线疾病特点和试验完成情况9
2.3 AS患者TNFα上游位点基因多态性对依那西普治疗的影响9
2.3.1 TNFα 238位点基因多态性对依那西普治疗后BASDAI及ASAS评分的影响9
2.3.2 TNFα 308位点基因多态性对依那西普治疗后BASDAI及ASAS评分的影响9
2.3.3 TNFα 857位点基因多态性对依那西普治疗后BASDAI及ASAS评分的影响9
2.3.4 TNFα 1031位点基因多态性对依那西普治疗后BASDAI及ASAS评分的影响10
3 讨论11
3.1 依那西普的治疗效果11
3.2 TNFα各位点基因多态性对依那西普治疗AS的影响12
致谢13
参考文献14
TNFα单核苷酸位点多态性与TNFα拮抗剂的药物基因组学研究
引言
强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis，AS）是一种以中轴关节病变为主，并可累及外周关节及内脏和其他组织的慢性自身免疫疾病。临床上以骶髂关节炎、肌腱端炎和脊柱炎为特点，严重时导致患者躯体功能丧失和残疾。AS在青壮年男性中发病率较高，平均发病年龄为26岁左右，全世界男女发病率的比例大约为2:1左右[1]，在中国，AS的患病率约为0.3%。AS是一种高患病率、高致残率，并会长期影响患者生活质量的疾病，也是临床分类诊断明确的多基因遗传病。
全基因组扫描、连锁和关联分析（GWAS）结果提示：除MHCⅠ类抗原HLAB27基因与AS强相关以外，在不同种族和不同地区的人群中也有不同的非HLAB27基因显示与AS相关[2,3]。目前在已发表的GWAS中，已总结得出非MHC（Major Histocompability Complex）区域中25个与AS相关的位点，主要在抗原呈递通路、IL23R信号通路以及TNF受体信号通路中起作用[47]。目前与AS发病研究较为深入的是白介素（interleukin，IL）家族，包括IL1、IL10、IL6等基因的多态性与AS的发病都有一定关系。Davidson等[4]对527名中国汉族AS患者和954名健康者进行SNP分型时发现，ERAP1（endoplasmic reticulum aminopeptidase1, ERAPl）在中国汉族人群以及高加索人群中与AS的发病均存在关联，而IL23R在中国人群中则与AS发病无关，这与高加索人群验证的结果不同，证明不同人群之间存在差异[7]。但以上关联分析存在局限性，这些非MHC区域基因仅仅可以解释少于25%的遗传因素，仍有近乎75%的未知区域有待解释，不排除罕见突变与拷贝数变异的可能性[8]，因此，对于未知区域，仍有待于进一步的研究。在MHC区域中，TNFα（Tumor Necrosis Factor, TNF）是与AS关联的重要基因[9]。TNFα基因定位于6号染色体短臂Ⅲ类MHC区域，与MHCⅠ类基因抗原HLAB27基因位置相近，已有大量研究证明，TNFα是AS易感基因之一[1,1013]。在TNFα基因序列中，其上游启动区具有调控TNFα转录和表达的作用，该区域有众多位点存在单核苷酸多态性。有研究表明这种多态性可以影响TNFα的转录和表达，从而导致体内TNFα水平的不同，进而影响疾病的发展[14,15]。
治疗AS的传统方法有多种，然而不同的治疗方法在不同个体之间的治疗效果差异显著[1618]。以TNFα为靶标的TNFα拮抗剂是治疗AS的生物制剂中应用最为广泛的一种，近年来的研究均显示其对患者的疾病活动度、患者的躯体功能和生活质量有明显改善[12,1921]。研究表明[9,22,23]，不同的位点多态性基因型风湿性疾病患者对TNFα拮抗剂治疗的疗效不同，提示这些位点不同的基因型可以作为预测治疗疗效的工具。药物基因组学研究表明基因多态性可能对药物代谢产生影响，也可能影响药物靶标或药物受体从而影响个体对药物的反应[24]。依那西普以TNFα为靶标，通过结合外周可溶性TNFα，阻止其与细胞膜上的受体进一步结合而发挥作用，因此可能更易受到TNFα基因多态性的影响。TNFα是AS的发病过程中的重要致炎因子，它的启动子区域基因多态性又可以影响TNFα水平，因此可以推测TNFα部分位点基因多态性与TNFα拮抗剂治疗的疗效之间可能存在某些联系[25,26]，目前在汉族人群中，TNFα位点基因多态性对依那西普治疗AS的疗效影响尚缺乏足够资料。因此，本课题拟研究并明确患者TNFα及其受体基因单核苷酸位点多态性与患者对TNFα拮抗剂的药效之间的关系，探讨基因多态性与靶向治疗的疗效的关联。在此之后，我们可以根据患者的基因型差异，建立个性化的治疗方案，指导患者用药，从而实现精准化医疗，为患者抓住宝贵的治疗时机，并减轻患者的经济负担，减轻药物副作用，对患者健康带来的影响。
1 材料与方法
1．1 研究对象
1．1．1 病例选择标准 2015年7月2016年2月，在上海光华医院以及上海长海医院风湿免疫科接受治疗的强直性脊柱炎患者。所有患者均符合1984年修订的纽约标准[27,28]，要求患者年龄2065岁，中国汉族人群，能够完全理解并正确填写有关问卷，入选前三个月内无服用激素及其他免疫抑制药物治疗史。共入选74例患者，均签署知情同意书。
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