葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑敏感性基线建立及抗药性分子机制
摘 要苯醚甲环唑是一种三唑类杀菌剂，具有高效、广谱的抗菌活性。本文建立了葡萄炭疽菌对苯醚甲环唑敏感性基线及抗药性分子机制，为葡萄炭疽病绿色防控奠定理论基础。结果表明采用菌丝生长速率法建立了葡萄炭疽菌对苯醚甲环唑的敏感性基线，平均EC50值为1.9906±0.04494μg/ml，EC50值分布成单峰曲线；从田间获得了抗苯醚甲环唑的葡萄炭疽病菌，抗性菌株的致病力强于敏感菌株，但是抗性菌株的菌丝生长速率和产孢能力比敏感菌株弱；苯醚甲环唑与丙环唑之间不存在交互抗性，但与咪鲜胺之间存在交互抗性；抗性菌株cyp5 1的编码区有65个核苷酸点突变，其中7个氨基酸密码子发生点突变。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言2
1材料与方法2
1.1供试菌株 2
1.2供试药剂与培养基 2
1.3葡萄炭疽病菌对不同类型杀菌剂的敏感性测定 2
1.4苯醚甲环唑抗、感菌株的生物学特性测定 3
1.4.1菌丝生长速率测定3
1.4.2产孢能力测定3
1.4.3致病力3
1.5苯醚甲环唑抗、感菌株1,4α脱甲基酶（cyp51）基因的克隆、分析3
1.5.1葡萄炭疽病菌基因组DNA的提取3
1.5.2 苯醚甲环唑抗、感菌株cyp 51基因的克隆及分析3 2结果与分析5 2.1感抗菌株对苯醚甲环唑的EC50测定5
2.2苯醚甲环唑对葡萄炭疽菌的生物学特性比较6
2.3交互抗性8
2.4苯醚甲环唑抗、感菌株1,4α脱甲基酶（cyp51）基因的克隆、分析9
3讨论 13
致谢14
参考文献15
葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑敏感性基线建立及抗药性分子机制
引言
葡萄炭疽病也称晚腐病，在全国大多数葡萄栽培地区均有分布[2]。葡萄炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），主要危害着色期和近成熟期的果实，也可危害幼果、叶片、叶柄、新稍、卷须、花穗、穗轴和果梗等，危害初期 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
病斑不明显。果实受害初期，果粒上产生褐色圆形小斑点，后期逐渐扩大凹陷产生轮纹状排列小黑点，即病菌的分生孢子盘，天气潮湿时病斑长出粉红色黏状物，即病菌的分生孢子团，严重时病斑扩展至半个果粒，引起果粒腐烂[1]。长期以来，生产上防治炭疽病的主要是依靠化学防治，但由于炭疽菌具有繁殖速度快、易发生遗传变异和生物适合度高等特性，极易产生抗药性[7]。目前，炭疽菌对多菌灵等杀菌剂已经产生了抗药性，并且炭疽病的多重抗药性问题日益严峻。抗药性的产生致使杀菌剂对炭疽病的防效大幅下降，甚至失效。因此，防治炭疽病的新药剂的筛选成为一个迫在眉睫的课题。苯醚甲环唑（Difenoconazole）一种高效广谱的三唑类杀菌剂，化学名称为顺，反3 氯4[4甲2（1H1，2，4 三唑 1 基甲基）1 ，3二噁戊烷2基]苯基4氯苯基（顺，反比例约为 45:55）。苯醚甲环唑作用机制主要抑制病菌细胞麦角甾醇的生物合成，从而破坏细胞膜结构与功能，主要用于果树、蔬菜、小麦、马铃薯、豆类、瓜类等作物，对蔬菜和瓜果等多种真菌性病害具有很好的保护和治疗作用。研究葡萄炭疽病对苯醚甲环唑的生物学活性、建立敏感性基线、分析抗药性机制对该药剂的安全和合理使用提供科学指导具有重要的现实意义。
1材料与方法
1.1供试菌株
供试菌株为葡萄炭疽病菌，采集自江苏省镇江市句容葡萄产区，由大学杀菌剂实验室保存、提供。
菌株分离：将采集到的病果用次氯酸钠消毒后，蘸取病健分界处橙色菌落转接到培养基上25℃条件下培养37天后，产孢后挑单孢，得到的单孢菌株培养后转接到斜面试管培养基上25℃条件下培养3天后，放到4℃冰箱中保存。
1.2药剂与培养基
96.3%苯醚甲环唑原药；98%丙环唑原药；97%咪鲜胺原药。分别预溶于甲醇配制成10000μg/ml的储备母液，4℃冰箱中保存。97.5%多菌灵原药，预溶于0.1 mol/L盐酸配制成10000μg/mlL的储备母液，4℃冰箱中保存。
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200g，葡萄糖20 g，琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L。
AEA培养基：酵母提取物5 g，NaNO3 6 g，KCl 0.5 g，KH2PO4 1.5 g，MgSO4 0.25 g，甘油20 mL，琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L；
水琼脂（WA）培养基：琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L。
以上培养基使用前均经高温高压灭菌，常温保存。
1.3 葡萄炭疽病菌对不同类型杀菌剂的敏感性测定
菌株活化：从保存菌种的试管中挑取菌丝块转接到PDA平板上，25℃培养5天。
分别制做苯醚甲环唑终浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/ml, 丙环唑浓度为0.00625、0.0125、0. 25、0.05、0.1μg/ml,咪鲜胺终浓度为0.25、0.5、1、2、4μg/ml的平板。
将供试菌株在PDA平板上于25℃预培养5天后，在菌落边缘用5 mm的打孔器打制菌碟。将菌碟菌丝面朝下接种于含系列浓度各药剂的PDA平板中央，每个浓度重复3皿。待25℃培养57天后，采用十字交叉法测量菌落直径（单位：mm），并计算出不同浓度处理下，各药剂分别对葡萄炭疽病菌菌丝生长的抑制率。
应用DPS软件，根据药剂浓度的对数值和抑制率的几率值之间的线性回归分析，计算出EC50值。本试验重复三次。
1.4苯醚甲环唑抗、感菌株的生物学特性测定
供试的8株苯醚甲环唑抗性菌株及1株敏感菌株与测定交互抗性所采用的菌株一致。
1.4.1 菌丝生长速率测定
预培养的供试菌株，沿菌落边缘打取5 mm菌碟，分别接种于不含药剂的PDA平板上，每个菌株重复3皿。25℃培养6天后，采用十字交叉法测量菌落直径。本试验重复3次。
1.4.2产孢能力测定
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言2
1材料与方法2
1.1供试菌株 2
1.2供试药剂与培养基 2
1.3葡萄炭疽病菌对不同类型杀菌剂的敏感性测定 2
1.4苯醚甲环唑抗、感菌株的生物学特性测定 3
1.4.1菌丝生长速率测定3
1.4.2产孢能力测定3
1.4.3致病力3
1.5苯醚甲环唑抗、感菌株1,4α脱甲基酶（cyp51）基因的克隆、分析3
1.5.1葡萄炭疽病菌基因组DNA的提取3
1.5.2 苯醚甲环唑抗、感菌株cyp 51基因的克隆及分析3 2结果与分析5 2.1感抗菌株对苯醚甲环唑的EC50测定5
2.2苯醚甲环唑对葡萄炭疽菌的生物学特性比较6
2.3交互抗性8
2.4苯醚甲环唑抗、感菌株1,4α脱甲基酶（cyp51）基因的克隆、分析9
3讨论 13
致谢14
参考文献15
葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑敏感性基线建立及抗药性分子机制
引言
葡萄炭疽病也称晚腐病，在全国大多数葡萄栽培地区均有分布[2]。葡萄炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），主要危害着色期和近成熟期的果实，也可危害幼果、叶片、叶柄、新稍、卷须、花穗、穗轴和果梗等，危害初期 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
病斑不明显。果实受害初期，果粒上产生褐色圆形小斑点，后期逐渐扩大凹陷产生轮纹状排列小黑点，即病菌的分生孢子盘，天气潮湿时病斑长出粉红色黏状物，即病菌的分生孢子团，严重时病斑扩展至半个果粒，引起果粒腐烂[1]。长期以来，生产上防治炭疽病的主要是依靠化学防治，但由于炭疽菌具有繁殖速度快、易发生遗传变异和生物适合度高等特性，极易产生抗药性[7]。目前，炭疽菌对多菌灵等杀菌剂已经产生了抗药性，并且炭疽病的多重抗药性问题日益严峻。抗药性的产生致使杀菌剂对炭疽病的防效大幅下降，甚至失效。因此，防治炭疽病的新药剂的筛选成为一个迫在眉睫的课题。苯醚甲环唑（Difenoconazole）一种高效广谱的三唑类杀菌剂，化学名称为顺，反3 氯4[4甲2（1H1，2，4 三唑 1 基甲基）1 ，3二噁戊烷2基]苯基4氯苯基（顺，反比例约为 45:55）。苯醚甲环唑作用机制主要抑制病菌细胞麦角甾醇的生物合成，从而破坏细胞膜结构与功能，主要用于果树、蔬菜、小麦、马铃薯、豆类、瓜类等作物，对蔬菜和瓜果等多种真菌性病害具有很好的保护和治疗作用。研究葡萄炭疽病对苯醚甲环唑的生物学活性、建立敏感性基线、分析抗药性机制对该药剂的安全和合理使用提供科学指导具有重要的现实意义。
1材料与方法
1.1供试菌株
供试菌株为葡萄炭疽病菌，采集自江苏省镇江市句容葡萄产区，由大学杀菌剂实验室保存、提供。
菌株分离：将采集到的病果用次氯酸钠消毒后，蘸取病健分界处橙色菌落转接到培养基上25℃条件下培养37天后，产孢后挑单孢，得到的单孢菌株培养后转接到斜面试管培养基上25℃条件下培养3天后，放到4℃冰箱中保存。
1.2药剂与培养基
96.3%苯醚甲环唑原药；98%丙环唑原药；97%咪鲜胺原药。分别预溶于甲醇配制成10000μg/ml的储备母液，4℃冰箱中保存。97.5%多菌灵原药，预溶于0.1 mol/L盐酸配制成10000μg/mlL的储备母液，4℃冰箱中保存。
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200g，葡萄糖20 g，琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L。
AEA培养基：酵母提取物5 g，NaNO3 6 g，KCl 0.5 g，KH2PO4 1.5 g，MgSO4 0.25 g，甘油20 mL，琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L；
水琼脂（WA）培养基：琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L。
以上培养基使用前均经高温高压灭菌，常温保存。
1.3 葡萄炭疽病菌对不同类型杀菌剂的敏感性测定
菌株活化：从保存菌种的试管中挑取菌丝块转接到PDA平板上，25℃培养5天。
分别制做苯醚甲环唑终浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/ml, 丙环唑浓度为0.00625、0.0125、0. 25、0.05、0.1μg/ml,咪鲜胺终浓度为0.25、0.5、1、2、4μg/ml的平板。
将供试菌株在PDA平板上于25℃预培养5天后，在菌落边缘用5 mm的打孔器打制菌碟。将菌碟菌丝面朝下接种于含系列浓度各药剂的PDA平板中央，每个浓度重复3皿。待25℃培养57天后，采用十字交叉法测量菌落直径（单位：mm），并计算出不同浓度处理下，各药剂分别对葡萄炭疽病菌菌丝生长的抑制率。
应用DPS软件，根据药剂浓度的对数值和抑制率的几率值之间的线性回归分析，计算出EC50值。本试验重复三次。
1.4苯醚甲环唑抗、感菌株的生物学特性测定
供试的8株苯醚甲环唑抗性菌株及1株敏感菌株与测定交互抗性所采用的菌株一致。
1.4.1 菌丝生长速率测定
预培养的供试菌株，沿菌落边缘打取5 mm菌碟，分别接种于不含药剂的PDA平板上，每个菌株重复3皿。25℃培养6天后，采用十字交叉法测量菌落直径。本试验重复3次。
1.4.2产孢能力测定
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