辣椒疫霉效应分子rxlr207功能初步分析
疫霉菌分泌的效应因子在干扰寄主植物的防卫反应中发挥着重要作用。疫霉菌可以编码数百个RxLR效应因子，然而，我们对这些效应因子的功能和作用机制还知之甚少。本研究前期利用农杆菌介导的瞬时表达体系等方法，筛选到一个能在本氏烟叶片上引起细胞死亡的效应因子RxLR207。利用PEG介导的疫霉转化技术在辣椒疫霉中沉默该效应子基因，获得了3个基因沉默转化子，并通过实时定量PCR及菌丝块接种方法分析了三个基因沉默转化子的致病力及菌丝定殖量。结果显示沉默转化子T217、T213和T79中RxLR207基因的相对表达量为分别为野生型对照的53.6%，68.9%，7.6%。各转化子在接种点的菌丝定殖量约为野生型的27.3%,56.6%,6.4%，差异极显著；亚细胞定位结果表明该效应因子分布在植物的细胞质中。本研究为进一步研究RxLR207的功能和作用机制奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言2
1材料与方法3
1.1材料3
1.1.1供试菌株3
1.1.2供试植物3
1.1.3试验用培养基3
1.2方法3
1.2.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞备 4
1.2.2 RNA提取及反转录cDNA4
1.2.3 重组质粒的构建4
1.2.4 农杆菌GV3101感受态细胞制备及转化8
1.2.5 拟南芥的稳定转化9
1.2.6 PEG介导的辣椒疫霉原生质体转化9
1.2.7 辣椒疫霉稳定转化子筛选9
1.2.8致病性检测10
1.2.9亚细胞定位10
2结果与分析10
2.1 RxLR207转基因拟南芥进展10
2.2 RxLR207沉默转化子的获得10
2.3 RxLR207沉默转化子的致病性测定10
2.4 RxLR207亚细胞定位观察12
3讨论12
致谢13
参考文献13 辣椒疫霉效应分子RxLR207功能初步分析
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
引言
卵菌是一类具有独特分类地位的茸鞭生物，能够引起多种植物的毁灭性病害。卵菌引起的病害能造成广泛的农业和林业损失，如马铃薯晚疫病引发的爱尔兰大饥荒和1990年左右美国西海岸的栎树猝死病就是其中代表。为了控制卵菌病害，世界各国的植物病理学工作者从不同角度对卵菌进行了大量地研究。过去由于卵菌独特的二倍体营养生长特性，以及缺乏有效的遗传与分子生物学技术，研究进程一度比较缓慢。随着基因沉默、线性DNA转化等理论和技术的引入[1]，多个卵菌物种(P.sojae、P.ramorum、P. infestans[2]、P.capsici、Pythium ultimum[3]、Hyaloperonospora parasitica、Pseudoperonospora cubensis[4])的全基因组测序已经完成。通过对这些基因组序列和结构的分析揭示了卵菌基因组在大小、致病相关基因、专性活体寄生等方面存在多样性[5]，并为病原菌遗传与致病机理、宿主－病原菌相互作用的特征（宿主的特异性，毒性策略等）以及宿主－病原菌相互作用的进化等各方面研究提供了大量的信息。这些无疑都加深了我们对于卵菌基因组结构及进化的认识，极大地推动了卵菌的研究进展。
疫霉病隶属于卵菌，其营养体为二倍体，主要以菌丝状态生长，在无性生活史阶段以多核、无隔膜的二倍体营养菌丝体形态存在，其在含水的介质上产生游动孢子囊。致病疫霉的孢子囊能够从孢囊梗上很容易的脱落下来传播，而大豆疫霉则不能。在适宜的温度下孢子囊可以直接萌发形成侵染菌丝通过寄主植物的自然孔口侵入寄主，孢子囊释放的游动孢子在水中游动，寻找合适寄主组织，然后休止停留后侵入。休止的游动孢子萌发产生一个芽管，然后形成附着胞侵入寄主[6]。
绝大多数疫霉菌属于半活体营养菌。在活体营养阶段，芽管通过吸器将细胞膜推入寄主细胞产生直接的寄主病原菌接口[7]，吸器分泌大量的酶或效应蛋白抑制寄主的防卫反应[8,9]。根据效应分子在寄主中的靶标位置，可将其分为质外体效应分子(apoplastic effectors)和细胞质效应分子(cytoplasmic effectors)。质外体外效应子主要包括细胞壁降解酶（CWDEs）、毒素和多种富含半胱氨酸的蛋白质；胞内效应因子主要包括RxLR和Crinkler (CRN) 两类。其中RxLR效应分子蛋白序列氮端有约20 个左右氨基酸残基的信号肽，其后隔4090 个氨基酸的位置紧跟着一段保守的RxLR（R，精氨酸；x，任意氨基酸；L，亮氨酸；R，精氨酸）蛋白基序[10]，负责将效应因子转运到寄主植物细胞[11,12]。此外也有研究指出RxLR基序可以通过与植物细胞膜上PI3P的结合,通过植物的内吞作用进入寄主细胞[13]，操纵和干扰寄主的各种生理生化过程，从而达到破坏防卫反应,促进自身侵染的目的。当寄主植物中含有与效应因子对应的抗病蛋白时，效应因子可被寄主植物识别，激发效应子触发的免疫反应(effectortriggered immunity, ETI)。研究发现，植物病原卵菌RxLR效应基因功能呈现出多样性特点[14,15],即具有抑制Bax诱导的细胞死亡功能、抑制PTI、ETI功能以及诱导细胞死亡、协同作用调控植物防卫反应等功能。
本研究首先利用PCR方法克隆效应因子RxLR207，接着通过PEG介导的辣椒疫霉原生质体转化将效应因子沉默，菌丝块接种烟草，亚细胞定位等方法分析其致病性，明确RxLR207定位的亚细胞场所。由于卵菌独特的二倍体营养生长特性，利用基因敲除技术对其基因功能进行研究存在一定的困难。目前，通常利用农杆菌瞬时表达系统来研究。拟南芥作为卵菌研究的模式种在抗病领域方面已被大量的使用和深入研究，是研究效应分子的绝佳材料。因此本项目利用农杆菌介导的遗传转化体系，以野生型拟南芥Col0为材料进行稳定转化，研究辣椒疫霉效应因子的致病机理及信号通路，为认识卵菌的致病机制提供线索。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1供试植物
野生型拟南芥Col0，在温室(1823°C,14h 光照/d、10h黑暗 /d交替)中种植将拟南芥种子经10%双氧水消毒后接种于MS培养基上，于22℃、光照10h培养12周，长出无菌苗后转移至坧石和土（2：1）混合物上培养。
1.1.2供试菌株
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）菌株LT263均为本实验室保存。辣椒疫霉菌在10%的V8固体培养基，25℃、黑暗条件培养。
1.1.3试验用培养基
LB配方：
Tryptone
10 g/L
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言2
1材料与方法3
1.1材料3
1.1.1供试菌株3
1.1.2供试植物3
1.1.3试验用培养基3
1.2方法3
1.2.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞备 4
1.2.2 RNA提取及反转录cDNA4
1.2.3 重组质粒的构建4
1.2.4 农杆菌GV3101感受态细胞制备及转化8
1.2.5 拟南芥的稳定转化9
1.2.6 PEG介导的辣椒疫霉原生质体转化9
1.2.7 辣椒疫霉稳定转化子筛选9
1.2.8致病性检测10
1.2.9亚细胞定位10
2结果与分析10
2.1 RxLR207转基因拟南芥进展10
2.2 RxLR207沉默转化子的获得10
2.3 RxLR207沉默转化子的致病性测定10
2.4 RxLR207亚细胞定位观察12
3讨论12
致谢13
参考文献13 辣椒疫霉效应分子RxLR207功能初步分析
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
引言
卵菌是一类具有独特分类地位的茸鞭生物，能够引起多种植物的毁灭性病害。卵菌引起的病害能造成广泛的农业和林业损失，如马铃薯晚疫病引发的爱尔兰大饥荒和1990年左右美国西海岸的栎树猝死病就是其中代表。为了控制卵菌病害，世界各国的植物病理学工作者从不同角度对卵菌进行了大量地研究。过去由于卵菌独特的二倍体营养生长特性，以及缺乏有效的遗传与分子生物学技术，研究进程一度比较缓慢。随着基因沉默、线性DNA转化等理论和技术的引入[1]，多个卵菌物种(P.sojae、P.ramorum、P. infestans[2]、P.capsici、Pythium ultimum[3]、Hyaloperonospora parasitica、Pseudoperonospora cubensis[4])的全基因组测序已经完成。通过对这些基因组序列和结构的分析揭示了卵菌基因组在大小、致病相关基因、专性活体寄生等方面存在多样性[5]，并为病原菌遗传与致病机理、宿主－病原菌相互作用的特征（宿主的特异性，毒性策略等）以及宿主－病原菌相互作用的进化等各方面研究提供了大量的信息。这些无疑都加深了我们对于卵菌基因组结构及进化的认识，极大地推动了卵菌的研究进展。
疫霉病隶属于卵菌，其营养体为二倍体，主要以菌丝状态生长，在无性生活史阶段以多核、无隔膜的二倍体营养菌丝体形态存在，其在含水的介质上产生游动孢子囊。致病疫霉的孢子囊能够从孢囊梗上很容易的脱落下来传播，而大豆疫霉则不能。在适宜的温度下孢子囊可以直接萌发形成侵染菌丝通过寄主植物的自然孔口侵入寄主，孢子囊释放的游动孢子在水中游动，寻找合适寄主组织，然后休止停留后侵入。休止的游动孢子萌发产生一个芽管，然后形成附着胞侵入寄主[6]。
绝大多数疫霉菌属于半活体营养菌。在活体营养阶段，芽管通过吸器将细胞膜推入寄主细胞产生直接的寄主病原菌接口[7]，吸器分泌大量的酶或效应蛋白抑制寄主的防卫反应[8,9]。根据效应分子在寄主中的靶标位置，可将其分为质外体效应分子(apoplastic effectors)和细胞质效应分子(cytoplasmic effectors)。质外体外效应子主要包括细胞壁降解酶（CWDEs）、毒素和多种富含半胱氨酸的蛋白质；胞内效应因子主要包括RxLR和Crinkler (CRN) 两类。其中RxLR效应分子蛋白序列氮端有约20 个左右氨基酸残基的信号肽，其后隔4090 个氨基酸的位置紧跟着一段保守的RxLR（R，精氨酸；x，任意氨基酸；L，亮氨酸；R，精氨酸）蛋白基序[10]，负责将效应因子转运到寄主植物细胞[11,12]。此外也有研究指出RxLR基序可以通过与植物细胞膜上PI3P的结合,通过植物的内吞作用进入寄主细胞[13]，操纵和干扰寄主的各种生理生化过程，从而达到破坏防卫反应,促进自身侵染的目的。当寄主植物中含有与效应因子对应的抗病蛋白时，效应因子可被寄主植物识别，激发效应子触发的免疫反应(effectortriggered immunity, ETI)。研究发现，植物病原卵菌RxLR效应基因功能呈现出多样性特点[14,15],即具有抑制Bax诱导的细胞死亡功能、抑制PTI、ETI功能以及诱导细胞死亡、协同作用调控植物防卫反应等功能。
本研究首先利用PCR方法克隆效应因子RxLR207，接着通过PEG介导的辣椒疫霉原生质体转化将效应因子沉默，菌丝块接种烟草，亚细胞定位等方法分析其致病性，明确RxLR207定位的亚细胞场所。由于卵菌独特的二倍体营养生长特性，利用基因敲除技术对其基因功能进行研究存在一定的困难。目前，通常利用农杆菌瞬时表达系统来研究。拟南芥作为卵菌研究的模式种在抗病领域方面已被大量的使用和深入研究，是研究效应分子的绝佳材料。因此本项目利用农杆菌介导的遗传转化体系，以野生型拟南芥Col0为材料进行稳定转化，研究辣椒疫霉效应因子的致病机理及信号通路，为认识卵菌的致病机制提供线索。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1供试植物
野生型拟南芥Col0，在温室(1823°C,14h 光照/d、10h黑暗 /d交替)中种植将拟南芥种子经10%双氧水消毒后接种于MS培养基上，于22℃、光照10h培养12周，长出无菌苗后转移至坧石和土（2：1）混合物上培养。
1.1.2供试菌株
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）菌株LT263均为本实验室保存。辣椒疫霉菌在10%的V8固体培养基，25℃、黑暗条件培养。
1.1.3试验用培养基
LB配方：
Tryptone
10 g/L
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