黄秋葵查尔酮合酶基因aechs的克隆与功能分析
黄秋葵是一种保健型蔬菜，其荚果具有抗氧化和抗疲劳的功效，而发挥其功效的主要活性成分为秋葵种子中的类黄酮和多酚物质。本研究从黄秋葵中克隆了类黄酮生物合成相关基因查尔酮合酶基因（AeCHS），该基因开放阅读框包含1170个核苷酸，编码389个氨基酸。构建植物表达载体，通过蘸花法将AeCHS基因导入拟南芥中，获得转基因拟南芥纯系植株。对转基因植株和对照植株总类黄酮含量测定，转基因拟南芥植株的总类黄酮含量显著高于对照。转基因植株的类黄酮生物合成途径中相关基因表达显著提高。抗逆性离体鉴定表明，转基因植株具有明显抗逆性。转基因植株的超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化酶（POD）活性显著提高，而过氧化氢（H2O2）含量和丙二醛（MDA）含量显著降低。活性氧（ROS）清除系统关键酶基因（AtSOD和AtPOD）表达量显著上调。这些结果表明，过表达AeCHS基因通过增加转基因植株类黄酮积累，激活ROS清除系统，降低H2O2含量和MDA含量，从而显著提高了转基因拟南芥植株的耐盐性和渗透胁迫抗性。AeCHS基因有极大的发展潜力，可用于增加有益的黄酮类的含量和提高植物对非生物胁迫抗性的潜力。关键词 拟南芥，黄秋葵，类黄酮，耐盐性，渗透胁迫抗性，AeCHS
目 录
1 引言 1
2 材料与方法 3
2.1 试验材料 3
2.2 黄秋葵AeCHS基因的克隆 3
2.3 AeCHS基因的序列分析 3
2.4 AeCHS基因转化拟南芥 3
2.5 转基因植株的分子鉴定 4
2.6 转基因植株类黄酮含量的测定 4
2.7 转基因植株抗逆性分析 4
2.8 转基因植株相关基因的表达分析 5
2.9 转基因植株抗性相关物质的测定 6
2.10 数据分析 6
3 结果与分析 7
3.1 AeCHS的克隆和序列分析 7
3.2 转基因植株中类黄酮含量分析 8
3.3转基因植株的抗逆性分析 11
3.4转基因植株类黄酮生物合成相关基因表达分析 12
3.5转基因植株中ROS积累分析 13
4 讨论 14
4.1 Ae *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
CHS的过表达增加了类黄酮的生物合成 14
4.2 AeCHS的过表达增加了对盐和渗透胁迫的耐受性 15
4.3 AeCHS的过表达减少了ROS的积累 15
结 论 17
致 谢 18
参 考 文 献 19
1 引言
在全球，盐胁迫和干旱胁迫对农作物的生长发育不利，严重影响农作物的产量，而这些已经严重威胁农业生产发展和满足全球迅速增长的人口的需求[1~5]。据报道，全球约20%的灌溉土壤正遭受不同程度盐胁迫的危害[6]。同时，全球水资源短缺问题及气候变化问题也正严重威胁可持续农业的发展[7]。在逆境下，植物在生长发育、生理生化等方面均会发生相应的变化，植物萎蔫甚至枯萎死亡，其中原初部位是细胞膜系统，并常伴随着一系列的次级作用，如细胞膜透性增大、MDA积累、膜脂过氧化加剧、细胞质外渗等，接着就会出现能耗增加、发育受抑制、光合速率下降、生长减缓、衰老加速等状况。因此，提高农作物的抗逆性显得十分必要，具有重要意义。一些研究显示，一些植物品种已经进化出相应的应对机制来抵抗不利环境，如通过生长发育调节、解毒作用机制、离子平衡和渗透调节适应胁迫环境[8~10]。
在盐胁迫下，植物叶片和根系组织会累积大量的无机和有机溶质进行渗透调节。在植物渗透调节过程中，可通过溶质的积累而维持较低的渗透势和膨压，以增强其抗逆性，这类溶质即为渗透调节物质，可分为两大类：一类是由植物从外界环境吸收，再积累在内部细胞中的无机离子，如Na+、K+、Ca2+和Mg2+等，主要参与液泡渗透势的调节；另一类是在细胞内合成的有机溶质，如甜菜碱、蔗糖、寡糖、脯氨酸、多胺物质等化合物，主要参与细胞质的渗透调节。当植物受到盐胁迫的侵害时，植物也可通过根组织的细胞质膜上的由氢离子梯度势驱动的Na+/H+反转运子将部分Na+由胞内排向胞外，进而减少其对植物的损害。植物还可以通过将液泡中Na+区域化进一步降低细胞质中的Na+浓度，这样不仅能够起到保护细胞质的作用，还能帮助细胞降低渗透压，从而减少伤害[9]。
类黄酮是植物体内广泛存在的次生代谢产物，对人体健康具有重要作用。从抗氧化剂和自由基清除剂方面来讲，类黄酮具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗过敏、抗癌、预防高血压及动脉硬化、抑制血小板聚集和血栓形成等。经研究发现，人们人均每天摄入约250 mg类黄酮，摄入渠道为各种食物和营养品，例如蔬菜、坚果、水果、植物营养品、维生素、矿物质补充剂、饮料和调料等食品。类黄酮主要有黄酮（flavones）、黄烷酮（flavanones）、花青素（anthocyanins）、黄酮醇（flavonols）、二氢黄酮醇（dihydroflavonols）、异黄酮（isoflavones）、查耳酮（chalcones）、二氢异黄酮（isoflavanones）、黄烷3醇（flavan3ols）、橙酮（aurones）和二氢查耳酮（dihydrochalcones）等。天然类黄酮分子的结构修饰方式主要有甲基化、羟基化、糖苷化和酰基化，其中糖苷化修饰最为普遍[11]。而且在植物组织中类黄酮存在形式多以苷类为主。此外，由于糖的种类、数量、连接位置和方式的不同，组成的类黄酮苷形式多样。据研究发现，大多数的植物通过光合作用产生的碳水化合物，在特定定条件下都被转化成类黄酮或与其紧密联系的物质。不同类黄酮由不同植物经过光合作用转变表达着不同的功能[11~12]。这些化合物在植物的生长发育过程中，保护自身免受植食性动物和病原体侵害，应对生物及非生物胁迫的过程中和在调节生理及发育信号等方面发挥着重要作用[13~16]。其中，花青素和PAs来自于苯丙氨酸合成途径，是类黄酮生物合成的最终产物[11，17~18]。
而查尔酮合酶（CHS）是类黄酮生物合成中的必需酶，调控着黄酮类成分的合成，也是黄酮代谢途径中第一个关键酶、限速酶，在植物界广泛分布，并且在植物的生长和适应环境方面起着重要作用。它通过催化1个单位的香豆酰辅酶A与3个单位的丙二酰辅酶A硫酯合成1个单位的柚皮素查尔酮，构成C6C3C6的基本骨架，这是植物体内苯丙氨酸合成途径中的第一个关键步骤，主导着类黄酮的生物合成[17，19~20]。据报道，查尔酮（CHS）基因的初次提取是从荷兰芹中[21]。此后，查尔酮被克隆并被广泛地应用于许多高等植物的研究当中，如：玉米、矮牵牛、大豆、兰花、拟南芥、高粱和紫茎泽兰等[22~28]。
目 录
1 引言 1
2 材料与方法 3
2.1 试验材料 3
2.2 黄秋葵AeCHS基因的克隆 3
2.3 AeCHS基因的序列分析 3
2.4 AeCHS基因转化拟南芥 3
2.5 转基因植株的分子鉴定 4
2.6 转基因植株类黄酮含量的测定 4
2.7 转基因植株抗逆性分析 4
2.8 转基因植株相关基因的表达分析 5
2.9 转基因植株抗性相关物质的测定 6
2.10 数据分析 6
3 结果与分析 7
3.1 AeCHS的克隆和序列分析 7
3.2 转基因植株中类黄酮含量分析 8
3.3转基因植株的抗逆性分析 11
3.4转基因植株类黄酮生物合成相关基因表达分析 12
3.5转基因植株中ROS积累分析 13
4 讨论 14
4.1 Ae *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
CHS的过表达增加了类黄酮的生物合成 14
4.2 AeCHS的过表达增加了对盐和渗透胁迫的耐受性 15
4.3 AeCHS的过表达减少了ROS的积累 15
结 论 17
致 谢 18
参 考 文 献 19
1 引言
在全球，盐胁迫和干旱胁迫对农作物的生长发育不利，严重影响农作物的产量，而这些已经严重威胁农业生产发展和满足全球迅速增长的人口的需求[1~5]。据报道，全球约20%的灌溉土壤正遭受不同程度盐胁迫的危害[6]。同时，全球水资源短缺问题及气候变化问题也正严重威胁可持续农业的发展[7]。在逆境下，植物在生长发育、生理生化等方面均会发生相应的变化，植物萎蔫甚至枯萎死亡，其中原初部位是细胞膜系统，并常伴随着一系列的次级作用，如细胞膜透性增大、MDA积累、膜脂过氧化加剧、细胞质外渗等，接着就会出现能耗增加、发育受抑制、光合速率下降、生长减缓、衰老加速等状况。因此，提高农作物的抗逆性显得十分必要，具有重要意义。一些研究显示，一些植物品种已经进化出相应的应对机制来抵抗不利环境，如通过生长发育调节、解毒作用机制、离子平衡和渗透调节适应胁迫环境[8~10]。
在盐胁迫下，植物叶片和根系组织会累积大量的无机和有机溶质进行渗透调节。在植物渗透调节过程中，可通过溶质的积累而维持较低的渗透势和膨压，以增强其抗逆性，这类溶质即为渗透调节物质，可分为两大类：一类是由植物从外界环境吸收，再积累在内部细胞中的无机离子，如Na+、K+、Ca2+和Mg2+等，主要参与液泡渗透势的调节；另一类是在细胞内合成的有机溶质，如甜菜碱、蔗糖、寡糖、脯氨酸、多胺物质等化合物，主要参与细胞质的渗透调节。当植物受到盐胁迫的侵害时，植物也可通过根组织的细胞质膜上的由氢离子梯度势驱动的Na+/H+反转运子将部分Na+由胞内排向胞外，进而减少其对植物的损害。植物还可以通过将液泡中Na+区域化进一步降低细胞质中的Na+浓度，这样不仅能够起到保护细胞质的作用，还能帮助细胞降低渗透压，从而减少伤害[9]。
类黄酮是植物体内广泛存在的次生代谢产物，对人体健康具有重要作用。从抗氧化剂和自由基清除剂方面来讲，类黄酮具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗过敏、抗癌、预防高血压及动脉硬化、抑制血小板聚集和血栓形成等。经研究发现，人们人均每天摄入约250 mg类黄酮，摄入渠道为各种食物和营养品，例如蔬菜、坚果、水果、植物营养品、维生素、矿物质补充剂、饮料和调料等食品。类黄酮主要有黄酮（flavones）、黄烷酮（flavanones）、花青素（anthocyanins）、黄酮醇（flavonols）、二氢黄酮醇（dihydroflavonols）、异黄酮（isoflavones）、查耳酮（chalcones）、二氢异黄酮（isoflavanones）、黄烷3醇（flavan3ols）、橙酮（aurones）和二氢查耳酮（dihydrochalcones）等。天然类黄酮分子的结构修饰方式主要有甲基化、羟基化、糖苷化和酰基化，其中糖苷化修饰最为普遍[11]。而且在植物组织中类黄酮存在形式多以苷类为主。此外，由于糖的种类、数量、连接位置和方式的不同，组成的类黄酮苷形式多样。据研究发现，大多数的植物通过光合作用产生的碳水化合物，在特定定条件下都被转化成类黄酮或与其紧密联系的物质。不同类黄酮由不同植物经过光合作用转变表达着不同的功能[11~12]。这些化合物在植物的生长发育过程中，保护自身免受植食性动物和病原体侵害，应对生物及非生物胁迫的过程中和在调节生理及发育信号等方面发挥着重要作用[13~16]。其中，花青素和PAs来自于苯丙氨酸合成途径，是类黄酮生物合成的最终产物[11，17~18]。
而查尔酮合酶（CHS）是类黄酮生物合成中的必需酶，调控着黄酮类成分的合成，也是黄酮代谢途径中第一个关键酶、限速酶，在植物界广泛分布，并且在植物的生长和适应环境方面起着重要作用。它通过催化1个单位的香豆酰辅酶A与3个单位的丙二酰辅酶A硫酯合成1个单位的柚皮素查尔酮，构成C6C3C6的基本骨架，这是植物体内苯丙氨酸合成途径中的第一个关键步骤，主导着类黄酮的生物合成[17，19~20]。据报道，查尔酮（CHS）基因的初次提取是从荷兰芹中[21]。此后，查尔酮被克隆并被广泛地应用于许多高等植物的研究当中，如：玉米、矮牵牛、大豆、兰花、拟南芥、高粱和紫茎泽兰等[22~28]。
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