南方根结线虫毒性相关基因cg1的同源克隆及病毒沉默载体的构建
南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是一种非常重要的植物内寄生线虫，每年给世界农业生产造成巨大的经济损失。南方根结线虫无毒群体突破Mi基因抗性转变为毒性群体，从而导致品种抗性丧失，目前这一毒性变异机制尚不明确。本文采用同源克隆的方法，从南方根结线虫无毒群体中克隆毒性Cg-1同源基因，Mi-Cg-1基因全长361bp，含义一个42bp的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），编码14个氨基酸，序列比对显示与已报道爪哇根结线虫无毒相关基因Cg-1相似度为98%。为进一步研究Mi-Cg-1基因与线虫无毒/毒性变异的相关性，本研究同时构建了Mi-Cg-1基因的TRV（Tobacco Rattle Virus，TRV）沉默载体，研究结果揭示线虫毒性变异机制，从而为有效防治根结线虫提供指导。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1供试线虫和主要试剂2
1.2方法 3
1.2.1南方根结线虫Cg1基因的同源克隆 3
1.2.1.1线虫RNA的提取3
1.2.1.2 cDNA的合成3
1.2.2 Cg1的扩增3
1.2.2.1 引物设计与合成.3
1.2.2.2 PCR扩增3
1.2.2.3 PCR产物克隆及序列测定4
1.2.2 .4序列比对和Blast分析4
1.2.3 TRV沉默载体的构建4
1.2.3.1酶切4
1.2.3.2 连接4
1.2.3.3 农杆菌转化4
2结果与分析5
2.1RNA检测5
2.2 Cg1基因克隆与序列比对5
2.3TRV沉默载体构建6
2.3.1载体目的序列的获得6
2.3.2TRV沉默载体菌落PCR检测6
2.3.3TRV沉默载体PCR扩增检测7
3讨论7
致谢8
参考文献9
南方根结线虫Cg1基因的同源 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
克隆
及病毒沉默载体的构建
引言
根结线虫（Meloidogyne spp.）属于垫刃目(Tylenchida)，垫刃亚目(Tylenchina)，异皮科(Heteroderidae)，根结亚科(Meloidogyninae)，根结线虫属(Meloidogyne)。是世界性分布的威胁农业生产的主要病原物之一，是植物根系定居性内寄生生物，是我国经济作物的重要病原线虫，主要包括南方根结线虫(M. incognita)、花生根结线虫(M. arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)和北方根结线虫(M. hapla)等4种常见根结线虫[1]。在我国以南方根结线虫分布最广危害最大。目前主要的防治策略包括农业防治、化学防治、生物防治和选用抗耐病品种等。种植抗病品种是目前最经济有效的防治手段，但可获得的抗性种质非常匮乏，其中应用最成功的是来自野生番茄的Mi基因，该基因对南方、爪哇和花生根结线虫都有较强的抗性，但该基因存在温度敏感性，当温度超过28或30度时，其介导的抗性会丧失，此外，由于单一抗性品种的连续种植，能够克服Mi基因抗性的根结线虫毒性群体相继出现[2]。因此，在这种形势下，尽早明确线虫寄生机制，提供新的抗线虫技术和手段显得尤为重要。
病原物毒性相关基因与寄主抗病基因的互作机制是病原微生物与植物的互作研究的重要内容。与细菌、真菌等病原物一样，植物寄生线虫也会分泌效应蛋白到寄主植物中引发寄主的效应子触发免疫反应，但目前在植物寄生线虫中鉴定的毒性基因（效应分子）还比较少，仅在根结线虫中对应番茄抗性基因Mi的2个候选无毒基因，即南方根结线虫map1基因[3]和爪哇根结线虫Cg1基因[4]。Cg1是在对爪哇根结线虫（M. javanica）近等基因系cDNA—AFLP的分析分离到的一个仅存在于线虫无毒群体中cDNA片段，将爪哇根结线虫无毒群体二龄幼虫通过体外dsRNA浸泡的方式对Cg1进行基因沉默，处理后的线虫对携带根结线虫抗性基因Mi的番茄表现出稳定的毒性，证实Cg1可能是毒性相关基因。然而，在其它毒性/无毒群体中是否也具有这种相同的变异机制目前尚不明确。
病毒介导的基因沉默（virusinduced gene silencing，VIGS) 技术为探究上述问题提供了有力的保障。VIGS是一种抗病毒防御反应机制，同时也是植物基因功能研究的重要工具，多种植物病毒被用于开发不同宿主范围和侵染方法的病毒载体[56]，其中由烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）由于其诱导基因沉默的效率高、持续时间久、引起温和的病症，并且能够侵染植物花、叶、茎、根等不同的器官，因此在烟草、番茄、马铃薯等植物的基因功能研究中发挥着重要的作用[78]。近年来，TRV介导的植物线虫基因沉默也获得了成功，Valentine等[9]首次利用TRV成功诱导了甜菜孢囊线虫甘油醛3磷酸脱氢酶基因（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase，GAPDH）的沉默，此后同样的策略被应用于根结线虫寄生相关基因的沉默研究[1011]。相比于此前植物线虫基因沉默研究中普遍运用的dsRNA体外浸泡和培育转基因植物等方式[1214]，TRV介导的植物线虫基因沉默具有操作简单且实验周期短等特点，在对多个基因高通量沉默分析时具有明显的优势，随着根结线虫基因组测序的完成[1516]，这种基因沉默方式将在线虫后基因组时代具有广阔的应用前景。
本研究拟以南方根结线虫为研究对象，首先同源克隆南方根结线虫Cg1基因，再利用TRV介导的基因沉默体系，测定抑制南方根结线虫Cg1基因的表达对线虫寄生抗性番茄能力的影响，进一步验证Cg1基因与根结线虫毒性变异的相关性。
1. 材料与方法
1.1 供试线虫和主要试剂
南方根结线虫MIJS3来自江苏省南京，原始寄主为番茄，经但卵块纯化后在感病番茄江蔬14号上培养，接种的番茄在25℃生长，自然光照。番茄接种后约45d，将根围土清洗干净，于解剖镜下挑取根上的卵块，然后用纯水清洗卵块2次。把卵块放在自制的双层网筛中，25℃于清水中孵化幼虫，每隔两天收集一次，收集的幼虫表面消毒后，80℃保存备用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1供试线虫和主要试剂2
1.2方法 3
1.2.1南方根结线虫Cg1基因的同源克隆 3
1.2.1.1线虫RNA的提取3
1.2.1.2 cDNA的合成3
1.2.2 Cg1的扩增3
1.2.2.1 引物设计与合成.3
1.2.2.2 PCR扩增3
1.2.2.3 PCR产物克隆及序列测定4
1.2.2 .4序列比对和Blast分析4
1.2.3 TRV沉默载体的构建4
1.2.3.1酶切4
1.2.3.2 连接4
1.2.3.3 农杆菌转化4
2结果与分析5
2.1RNA检测5
2.2 Cg1基因克隆与序列比对5
2.3TRV沉默载体构建6
2.3.1载体目的序列的获得6
2.3.2TRV沉默载体菌落PCR检测6
2.3.3TRV沉默载体PCR扩增检测7
3讨论7
致谢8
参考文献9
南方根结线虫Cg1基因的同源 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
克隆
及病毒沉默载体的构建
引言
根结线虫（Meloidogyne spp.）属于垫刃目(Tylenchida)，垫刃亚目(Tylenchina)，异皮科(Heteroderidae)，根结亚科(Meloidogyninae)，根结线虫属(Meloidogyne)。是世界性分布的威胁农业生产的主要病原物之一，是植物根系定居性内寄生生物，是我国经济作物的重要病原线虫，主要包括南方根结线虫(M. incognita)、花生根结线虫(M. arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)和北方根结线虫(M. hapla)等4种常见根结线虫[1]。在我国以南方根结线虫分布最广危害最大。目前主要的防治策略包括农业防治、化学防治、生物防治和选用抗耐病品种等。种植抗病品种是目前最经济有效的防治手段，但可获得的抗性种质非常匮乏，其中应用最成功的是来自野生番茄的Mi基因，该基因对南方、爪哇和花生根结线虫都有较强的抗性，但该基因存在温度敏感性，当温度超过28或30度时，其介导的抗性会丧失，此外，由于单一抗性品种的连续种植，能够克服Mi基因抗性的根结线虫毒性群体相继出现[2]。因此，在这种形势下，尽早明确线虫寄生机制，提供新的抗线虫技术和手段显得尤为重要。
病原物毒性相关基因与寄主抗病基因的互作机制是病原微生物与植物的互作研究的重要内容。与细菌、真菌等病原物一样，植物寄生线虫也会分泌效应蛋白到寄主植物中引发寄主的效应子触发免疫反应，但目前在植物寄生线虫中鉴定的毒性基因（效应分子）还比较少，仅在根结线虫中对应番茄抗性基因Mi的2个候选无毒基因，即南方根结线虫map1基因[3]和爪哇根结线虫Cg1基因[4]。Cg1是在对爪哇根结线虫（M. javanica）近等基因系cDNA—AFLP的分析分离到的一个仅存在于线虫无毒群体中cDNA片段，将爪哇根结线虫无毒群体二龄幼虫通过体外dsRNA浸泡的方式对Cg1进行基因沉默，处理后的线虫对携带根结线虫抗性基因Mi的番茄表现出稳定的毒性，证实Cg1可能是毒性相关基因。然而，在其它毒性/无毒群体中是否也具有这种相同的变异机制目前尚不明确。
病毒介导的基因沉默（virusinduced gene silencing，VIGS) 技术为探究上述问题提供了有力的保障。VIGS是一种抗病毒防御反应机制，同时也是植物基因功能研究的重要工具，多种植物病毒被用于开发不同宿主范围和侵染方法的病毒载体[56]，其中由烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）由于其诱导基因沉默的效率高、持续时间久、引起温和的病症，并且能够侵染植物花、叶、茎、根等不同的器官，因此在烟草、番茄、马铃薯等植物的基因功能研究中发挥着重要的作用[78]。近年来，TRV介导的植物线虫基因沉默也获得了成功，Valentine等[9]首次利用TRV成功诱导了甜菜孢囊线虫甘油醛3磷酸脱氢酶基因（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase，GAPDH）的沉默，此后同样的策略被应用于根结线虫寄生相关基因的沉默研究[1011]。相比于此前植物线虫基因沉默研究中普遍运用的dsRNA体外浸泡和培育转基因植物等方式[1214]，TRV介导的植物线虫基因沉默具有操作简单且实验周期短等特点，在对多个基因高通量沉默分析时具有明显的优势，随着根结线虫基因组测序的完成[1516]，这种基因沉默方式将在线虫后基因组时代具有广阔的应用前景。
本研究拟以南方根结线虫为研究对象，首先同源克隆南方根结线虫Cg1基因，再利用TRV介导的基因沉默体系，测定抑制南方根结线虫Cg1基因的表达对线虫寄生抗性番茄能力的影响，进一步验证Cg1基因与根结线虫毒性变异的相关性。
1. 材料与方法
1.1 供试线虫和主要试剂
南方根结线虫MIJS3来自江苏省南京，原始寄主为番茄，经但卵块纯化后在感病番茄江蔬14号上培养，接种的番茄在25℃生长，自然光照。番茄接种后约45d，将根围土清洗干净，于解剖镜下挑取根上的卵块，然后用纯水清洗卵块2次。把卵块放在自制的双层网筛中，25℃于清水中孵化幼虫，每隔两天收集一次，收集的幼虫表面消毒后，80℃保存备用。
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