拟南芥花粉管中特异表达的rlks的荧光动态观察(附件)
摘要：双受精是被子植物特有的有性生殖过程。受精过程中两个雄配子（精细胞）随着花粉管一起与一系列雌蕊组织接触后进入胚珠分别与雌配子和中央细胞融合。这个过程需要花粉管和雌蕊组织间持续的相互作用，相关细胞产生各种信号进行交流。位于细胞膜上的植物类受体激酶（Receptor-like Kinases, RLKs）通常作为受体识别胞外作为配体的小肽分子，并将胞外信号传递至胞内。这种信号转导途径在植物生长发育中具有重要作用。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，RLKs家族包含超过610个成员，参与拟南芥生长发育各个阶段的调控，但到目前为止，该家族成员在双受精过程中的功能所知甚少。本研究主要是依据本实验室的RNA-seq数据，找到了57个在花粉管中高表达或者特异表达的RLKs，我们选取了其中具有特异表达模式的41个作为研究对象。在大多数情况下，RLKs在被配体激活后会通过内吞途径从膜上转运至某一亚细胞区室，最终在液泡被降解，这一过程可以通过观察RLK-荧光蛋白的信号观察到。本研究中，我们使用了一个对pH值敏感的嵌合荧光蛋白（融合mCherry和GFP），通过Gibson Assembly反应与Gateway克隆技术，将11个RLKs基因克隆并融合到这一pH敏感嵌合荧光蛋白上，然后使它们在自身启动子驱动下在转基因植株中表达。初步实验结果表明，我们在两个RLK基因（即ANXUR1和ANXUR2）的转基因植株中观察到了荧光的动态变化，证明了这个pH敏感的嵌合荧光系统用于观察花粉管生长过程中RLKs的动态变化的可行性。转基因植株的构建及这一新的荧光系统的应用将会为鉴定参与花粉管生长和导向信号转导途径的受体提供新思路。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言（或绪论）2
1材料与方法3
1.1实验材料及主要仪器3
1.2实验方法 3
1.2.1植物种植与培养3
1.2.2 RLKs基因克隆3
1.2.2.1 CTAB法提取野生型拟南芥基因组DNA3
1.2.2.2 Nested PCR扩增目的基因4
1.2.2.3 Gibso
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
n Asembly反应构建入门克隆载体5
1.2.2.4 LR反应构建表达克隆载体7
1.2.3 转基因植株的构建 7
1.2.3.1 质粒转化农杆菌（电转化） 7
1.2.3.2 农杆菌侵染植物 8
1.2.3.3 获得转基因植株 8
1.2.4 观察转基因植株花粉管中的荧光动态变化 9
1.2.4.1 转基因植株花粉粒荧光的初步观察 9
1.2.4.2 纯体外萌发观察花粉管中的荧光动态 9
1.2.4.3纯体外萌发观察花粉管中的荧光动态 9
2 结果与分析 9
2.1 RLKs基因克隆结果 9
2.1.1 Nested PCR扩增RLKs基因 9
2.1.2 入门克隆载体构建结果10
2.1.3表达克隆载体构建结果10
2.2 转基因植株的构建11
2.2.1 质粒转化农杆菌11
2.2.2 获得转基因植株11
2.3 转基因植株花粉管中RLKs的荧光动态观察11
2.3.1 转基因植株花粉粒荧光的观察结果11
2.3.2 体外萌发观察花粉管中的荧光动态变化13
3 讨论14
致谢 16
参考文献 17
拟南芥花粉管中特异表达的RLKs的荧光动态观察
引言
引言
双受精是被子植物特有的有性生殖方式。由于雌雄配子体在空间上被分隔开，雌配子体（即胚囊）位于雌蕊的子房腔内，精细胞被包裹在花粉管中且自身不会移动，因此需要依靠花粉管的伸长将精细胞运送到雌配子体从而完成双受精[1]。要想成功实现双受精，植物需要经历很多步骤：一、花粉粒黏附在柱头表面，水合并萌发长出花粉管；二、花粉管与柱头乳突细胞识别，并穿过柱头和花柱；三、花粉管沿着引导组织生长；四、花粉管穿出隔膜进入子房腔内，并沿着珠柄生长；五、花粉管通过珠孔进入胚囊，释放出2个精细胞，完成双受精过程[2]。为保证双受精的顺利完成，花粉（管）和不同雌性组织之间必然要发生复杂的相互作用。
植物类受体激酶（Receptorlike Kinases, RLKs）是一类重要的蛋白激酶，参与植物生长发育调控的许多过程。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，发现存在610多个RLKs，但到目前为止，该家族成员在双受精过程中的功能所知甚少[3]。依据本实验室的RNAseq数据[4]，我们找到了57个在花粉管中特异或者高表达的RLKs基因，这种特异或者高表达的模式暗示着它们可能参与了花粉管与雌性组织之间的互作和识别。因此，研究这些RLKs基因的功能将有助于我们更好地理解双受精过程中雌雄相互作用的机制，揭示植物生殖背后的奥秘。
已有的研究表明，植物细胞中定位在质膜表面的RLKs会发生内吞转移过程：首先从质膜脱落，进入早期内吞体，之后一部分受体会返回膜上继续行使受体功能，而绝大部分则会进入晚期内吞体，最终进入液泡并被降解[5]。2007年，Shunsake等人[6]在观察动物细胞的自噬过程时发现，用GFPLC3（microtubule?associated protein 1 (MAP1) light chain 3，自噬体最常用的一种标记蛋白）标记的自噬体在与溶酶体融合后会发生荧光淬灭，绿色荧光消失，但用RFP（Red Florescent Proten）LC3标记时却不会发生这一现象；之后，他们又将LC3同时融合GFP和RFP，发现自噬体在与溶酶体融合后，黄色荧光变为红色，GFP绿色荧光消失。在动物细胞中，溶酶体承担着蛋白的消化功能，其PH值比胞质中低，酸性环境及一些水解酶的作用可能导致了GFP的降解。植物细胞中的液泡与动物细胞中的溶酶体承担着相似的功能，并且液泡的PH也低于胞质，这暗示着在植物细胞中，我们也可能通过建立双荧光系统，观察到RLKs内吞转移过程中荧光的动态变化。
ANXUR1（ANX1）—At3G04690，ANXUR2（ANX2）—At5G28680属于Catharantus reseus RLK1like（CrRLK1L）亚家族，是在拟南芥雄配子中特异表达的2个RLKs，在维持花粉管顶端细胞壁的完整性中起到重要作用，anx1/anx2双突变体的花粉管在到达胚囊之前即发生破裂，双受精不能完成[7]。根据已有的研究，ANX1/2在生长中的花粉管中可以通过胞吐作用定位在质膜上，由于花粉管具有极性生长的特点，ANX1/2在质膜上表现为不对称分布，在花粉管顶端的质膜上积累最多，并且在亚顶端囊泡运输最活跃的区域也有较强分布[8]。通过对ANX1、ANX2转基因植株花粉管进行荧光动态观察，并结合已有的研究成果，我们将初步探测双荧光体系用于筛选植物受体的可行性。
1 材料与方法
实验材料及主要仪器
本研究中使用的植物材料均为哥伦比亚生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana, Columbia0），种子由本实验室提供。
克隆所用菌株为大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli?）DH5α，由本实验室提供。
农杆菌菌株为GV3101，由本实验室提供。
PCR试剂来自于日本TOYOPO公司，DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒来自Omega公司，Gibson Assembly试剂盒购自NEB公司，LR酶购自Invitrogen公司，限制性内切酶购自Takara公司，其他试剂来自Sigma公司。
主要仪器包括离心机、PCR仪、涡旋振荡仪、光照培养箱、微波炉、电泳仪、恒温培养箱等。
1．2 实验方法
1.2.1 植物种植与培养
1) 配置1/2 MS培养基：
成分
含量（1 L）
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言（或绪论）2
1材料与方法3
1.1实验材料及主要仪器3
1.2实验方法 3
1.2.1植物种植与培养3
1.2.2 RLKs基因克隆3
1.2.2.1 CTAB法提取野生型拟南芥基因组DNA3
1.2.2.2 Nested PCR扩增目的基因4
1.2.2.3 Gibso
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
n Asembly反应构建入门克隆载体5
1.2.2.4 LR反应构建表达克隆载体7
1.2.3 转基因植株的构建 7
1.2.3.1 质粒转化农杆菌（电转化） 7
1.2.3.2 农杆菌侵染植物 8
1.2.3.3 获得转基因植株 8
1.2.4 观察转基因植株花粉管中的荧光动态变化 9
1.2.4.1 转基因植株花粉粒荧光的初步观察 9
1.2.4.2 纯体外萌发观察花粉管中的荧光动态 9
1.2.4.3纯体外萌发观察花粉管中的荧光动态 9
2 结果与分析 9
2.1 RLKs基因克隆结果 9
2.1.1 Nested PCR扩增RLKs基因 9
2.1.2 入门克隆载体构建结果10
2.1.3表达克隆载体构建结果10
2.2 转基因植株的构建11
2.2.1 质粒转化农杆菌11
2.2.2 获得转基因植株11
2.3 转基因植株花粉管中RLKs的荧光动态观察11
2.3.1 转基因植株花粉粒荧光的观察结果11
2.3.2 体外萌发观察花粉管中的荧光动态变化13
3 讨论14
致谢 16
参考文献 17
拟南芥花粉管中特异表达的RLKs的荧光动态观察
引言
引言
双受精是被子植物特有的有性生殖方式。由于雌雄配子体在空间上被分隔开，雌配子体（即胚囊）位于雌蕊的子房腔内，精细胞被包裹在花粉管中且自身不会移动，因此需要依靠花粉管的伸长将精细胞运送到雌配子体从而完成双受精[1]。要想成功实现双受精，植物需要经历很多步骤：一、花粉粒黏附在柱头表面，水合并萌发长出花粉管；二、花粉管与柱头乳突细胞识别，并穿过柱头和花柱；三、花粉管沿着引导组织生长；四、花粉管穿出隔膜进入子房腔内，并沿着珠柄生长；五、花粉管通过珠孔进入胚囊，释放出2个精细胞，完成双受精过程[2]。为保证双受精的顺利完成，花粉（管）和不同雌性组织之间必然要发生复杂的相互作用。
植物类受体激酶（Receptorlike Kinases, RLKs）是一类重要的蛋白激酶，参与植物生长发育调控的许多过程。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，发现存在610多个RLKs，但到目前为止，该家族成员在双受精过程中的功能所知甚少[3]。依据本实验室的RNAseq数据[4]，我们找到了57个在花粉管中特异或者高表达的RLKs基因，这种特异或者高表达的模式暗示着它们可能参与了花粉管与雌性组织之间的互作和识别。因此，研究这些RLKs基因的功能将有助于我们更好地理解双受精过程中雌雄相互作用的机制，揭示植物生殖背后的奥秘。
已有的研究表明，植物细胞中定位在质膜表面的RLKs会发生内吞转移过程：首先从质膜脱落，进入早期内吞体，之后一部分受体会返回膜上继续行使受体功能，而绝大部分则会进入晚期内吞体，最终进入液泡并被降解[5]。2007年，Shunsake等人[6]在观察动物细胞的自噬过程时发现，用GFPLC3（microtubule?associated protein 1 (MAP1) light chain 3，自噬体最常用的一种标记蛋白）标记的自噬体在与溶酶体融合后会发生荧光淬灭，绿色荧光消失，但用RFP（Red Florescent Proten）LC3标记时却不会发生这一现象；之后，他们又将LC3同时融合GFP和RFP，发现自噬体在与溶酶体融合后，黄色荧光变为红色，GFP绿色荧光消失。在动物细胞中，溶酶体承担着蛋白的消化功能，其PH值比胞质中低，酸性环境及一些水解酶的作用可能导致了GFP的降解。植物细胞中的液泡与动物细胞中的溶酶体承担着相似的功能，并且液泡的PH也低于胞质，这暗示着在植物细胞中，我们也可能通过建立双荧光系统，观察到RLKs内吞转移过程中荧光的动态变化。
ANXUR1（ANX1）—At3G04690，ANXUR2（ANX2）—At5G28680属于Catharantus reseus RLK1like（CrRLK1L）亚家族，是在拟南芥雄配子中特异表达的2个RLKs，在维持花粉管顶端细胞壁的完整性中起到重要作用，anx1/anx2双突变体的花粉管在到达胚囊之前即发生破裂，双受精不能完成[7]。根据已有的研究，ANX1/2在生长中的花粉管中可以通过胞吐作用定位在质膜上，由于花粉管具有极性生长的特点，ANX1/2在质膜上表现为不对称分布，在花粉管顶端的质膜上积累最多，并且在亚顶端囊泡运输最活跃的区域也有较强分布[8]。通过对ANX1、ANX2转基因植株花粉管进行荧光动态观察，并结合已有的研究成果，我们将初步探测双荧光体系用于筛选植物受体的可行性。
1 材料与方法
实验材料及主要仪器
本研究中使用的植物材料均为哥伦比亚生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana, Columbia0），种子由本实验室提供。
克隆所用菌株为大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli?）DH5α，由本实验室提供。
农杆菌菌株为GV3101，由本实验室提供。
PCR试剂来自于日本TOYOPO公司，DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒来自Omega公司，Gibson Assembly试剂盒购自NEB公司，LR酶购自Invitrogen公司，限制性内切酶购自Takara公司，其他试剂来自Sigma公司。
主要仪器包括离心机、PCR仪、涡旋振荡仪、光照培养箱、微波炉、电泳仪、恒温培养箱等。
1．2 实验方法
1.2.1 植物种植与培养
1) 配置1/2 MS培养基：
成分
含量（1 L）
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