稻瘟病菌细胞壁完整性通路蛋白参与细胞自噬的功能分析
在真核生物中，MAPK级联途径位于细胞信号传导网络的中心，参与调控细胞的生长分化、新陈代谢及病原物的侵染等多种生理过程。近年来，MAPK级联途径核心组分间的识别和活化的分子作用机制以及其上游受体和下游靶蛋白的鉴定已成为细胞信号转导研究的热点。细胞自噬是一类参与维持真核生物正常生理功能的亚细胞降解途径，对真核生物细胞内物质的周转具有重要作用。在细胞自噬过程中，损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体 (动物) 或液泡(酵母和植物) 中进行降解并得以循环利用。本文通过对稻瘟病菌细胞壁完整性组分（MoMck1，MoMkk1，MoMps1）与细胞自噬相关基因(ATG) 间的互作关系研究，寻找细胞壁完整性通路与细胞自噬过程的交叉点，进一步揭示MAPK转导途径在细胞逆境下维持生存中的作用。
目录
摘要................................................................................................................................1
关键词............................................................................................................................1
Abstract.....1
Key words..1
引言............................................................................................................1
1 材料与方法................................................................................3
1.1 材料.............................................................................................. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
...3
1.2 方法.....................................................................................3
1.2.1 酵母双杂交载体的构建 ................................................................3
1.2.2 酵母双杂LacZ活性检测........................................................................3
1.2.3稻瘟病菌的原生质体转化................................................................................3
2 结果与分析.................................................................................................................4
2.1 稻瘟病菌中的细胞壁完整性（CWI）组分缺失突变体影响细胞自噬过程..4
2.2 稻瘟病菌中CWI组分与细胞自噬基因（ATG）的酵母双杂交载体构建5
2.3 稻瘟病菌中CWI组分与ATG基因的互作关系验证..5
3 讨论.6
致谢.6
参考文献.8
图1 GFPMoAtg8的降解和定位观察 .5
图2部分的与细胞壁完整性组分互作的ATG基因...6
+
稻瘟病菌细胞壁完整性通路蛋白参与细胞自噬的功能分析
引言
引言
稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的世界水稻生产上的毁灭性真菌病害，该病害严重危及全球水稻的生产，每年平均损失20%左右。长期以来人们广泛地选育抗病品种防治此病，但由于该病原菌的致病性易变，新产生的致病小种导致选育出的抗病品种失去利用价值。因此，稻瘟病的防治始终是水稻生产上的一个重要难题，而控制该病原菌的一个重要前提是了解其生长发育及其致病过程的分子作用机制。对稻瘟病菌和水稻寄主相互识别、相互作用这一特异互作过程中的信号分子机制的解析有助于深入了解稻瘟病菌的致病机理， 同时有望为设计新型杀菌剂、提出新的植物病害控制策略提供理论依据。
前期的研究中发现，稻瘟病菌的附着胞的发育同细胞周期的调控紧密相关 [1]。使用细胞周期进程抑制剂hydroxyuatea和benonyyl可将细胞分别阻止在S期或者G2期。将稻瘟病菌的分生孢子接种在疏水膜上0 h和4 h，采用上述药剂处理，发现芽管当中有丝分裂被抑制，附着胞的发育被阻断。细胞有丝分裂参与附着胞形态发生的遗传学证据来自对一个调控有丝分裂的蛋白激酶MgNIMA编码基因的温度敏感性突变体的分析[2]，通过同源重组的方法将温度敏感性的条件性等位基因MgnimaE37G转化到稻瘟病菌中，发现将萌发的分生孢子放置在限制性温度的环境中，有丝分裂受到阻断，附着胞的发育也受到抑制。在稻瘟病菌的附着胞发育过程中分生孢子胞内物质通过芽管转运到附着胞中，这一过程伴随着分生孢子的崩解和死亡。分生孢子在附着胞形成过程中的死亡是以一种细胞自噬的方式进行的，MoATG8在稻瘟病菌中编码蛋白是细胞自噬过程所必需的一个蛋白，该基因的敲除导致分生孢子不能正常的进行崩解，进而造成稻瘟病菌致病力丧失[3,4,5]。进一步研究发现MoATG8缺失突变体形成的附着胞不能够产生穿透菌丝进而侵染水稻。这些研究说明，在稻瘟病菌附着胞发育过程受到细胞周期的调节，在对稻瘟病菌与寄主植物互作过程中，为了对该病菌分生孢子当中的物质进行再利用，稻瘟病菌细胞发生自噬性的程序化死亡。
蛋白质的磷酸化与去磷酸化是生物体重普遍存在的一类重要的信号传导调节机制。通过这个过程细胞将多种胞外信号逐级放大并最终传递到细胞核内，调控一系列基因的转录，从而使生物体对外界环境的刺激做出应答。MAPK级联途径位于细胞信号传导网络的中心，参与调控细胞的生长分化新陈代谢、应答外界不良环境及病原物的侵染等多种生理过程。在对稻瘟病菌前期的研究中中，已经鉴定出同酵母FUS3/KSS1，SLT2和HOG1同源的PMK1，MPS1，OSM1 3个不同的MAPK通路[6,7]。在一些植物病原真菌中，已经对同稻瘟病菌MPS1同源的MAPK基因进行了功能分析。结果显示MAPK信号通路作为真菌致病性调节组分具有保守性。在酿酒酵母中，与细胞壁完整性(CWI)相关的MAPK信号途径是细胞对于胞内信号和外界环境条件刺激应答的重要调控手段之一[8,9,10]。CWI 信号通路的激活依赖于5个表面信号感知蛋白Wsc1，Wsc2，Wsc3，Mid2和Mtl1。在细胞受到外界的细胞壁压力刺激时，这些感受器与鸟苷酸交换因子Rom2相互作用，Rom2进而激活Rho家族的GTP酶Rho1并且将其重新释放回细胞膜上。Rho1激活蛋白激酶C(Pkc1)，后者磷酸化保守的MAP激酶串联体最上游的蛋白激酶Bck1(MAPKKK)。Bck1接着将信号传递给蛋白激酶Mkk1/Mkk2(MAPKK)，然后再传递给蛋白激酶Mpk1/Slt2(MAPK)。最后Mpk1/Slt2磷酸化转录因子Rlm1和SBF复合体(包括Swi4和Swi6)，来进一步调节细胞核中与细胞壁合成及重建和细胞周期相关的基因的表达[11] 。
目录
摘要................................................................................................................................1
关键词............................................................................................................................1
Abstract.....1
Key words..1
引言............................................................................................................1
1 材料与方法................................................................................3
1.1 材料.............................................................................................. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
...3
1.2 方法.....................................................................................3
1.2.1 酵母双杂交载体的构建 ................................................................3
1.2.2 酵母双杂LacZ活性检测........................................................................3
1.2.3稻瘟病菌的原生质体转化................................................................................3
2 结果与分析.................................................................................................................4
2.1 稻瘟病菌中的细胞壁完整性（CWI）组分缺失突变体影响细胞自噬过程..4
2.2 稻瘟病菌中CWI组分与细胞自噬基因（ATG）的酵母双杂交载体构建5
2.3 稻瘟病菌中CWI组分与ATG基因的互作关系验证..5
3 讨论.6
致谢.6
参考文献.8
图1 GFPMoAtg8的降解和定位观察 .5
图2部分的与细胞壁完整性组分互作的ATG基因...6
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稻瘟病菌细胞壁完整性通路蛋白参与细胞自噬的功能分析
引言
引言
稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的世界水稻生产上的毁灭性真菌病害，该病害严重危及全球水稻的生产，每年平均损失20%左右。长期以来人们广泛地选育抗病品种防治此病，但由于该病原菌的致病性易变，新产生的致病小种导致选育出的抗病品种失去利用价值。因此，稻瘟病的防治始终是水稻生产上的一个重要难题，而控制该病原菌的一个重要前提是了解其生长发育及其致病过程的分子作用机制。对稻瘟病菌和水稻寄主相互识别、相互作用这一特异互作过程中的信号分子机制的解析有助于深入了解稻瘟病菌的致病机理， 同时有望为设计新型杀菌剂、提出新的植物病害控制策略提供理论依据。
前期的研究中发现，稻瘟病菌的附着胞的发育同细胞周期的调控紧密相关 [1]。使用细胞周期进程抑制剂hydroxyuatea和benonyyl可将细胞分别阻止在S期或者G2期。将稻瘟病菌的分生孢子接种在疏水膜上0 h和4 h，采用上述药剂处理，发现芽管当中有丝分裂被抑制，附着胞的发育被阻断。细胞有丝分裂参与附着胞形态发生的遗传学证据来自对一个调控有丝分裂的蛋白激酶MgNIMA编码基因的温度敏感性突变体的分析[2]，通过同源重组的方法将温度敏感性的条件性等位基因MgnimaE37G转化到稻瘟病菌中，发现将萌发的分生孢子放置在限制性温度的环境中，有丝分裂受到阻断，附着胞的发育也受到抑制。在稻瘟病菌的附着胞发育过程中分生孢子胞内物质通过芽管转运到附着胞中，这一过程伴随着分生孢子的崩解和死亡。分生孢子在附着胞形成过程中的死亡是以一种细胞自噬的方式进行的，MoATG8在稻瘟病菌中编码蛋白是细胞自噬过程所必需的一个蛋白，该基因的敲除导致分生孢子不能正常的进行崩解，进而造成稻瘟病菌致病力丧失[3,4,5]。进一步研究发现MoATG8缺失突变体形成的附着胞不能够产生穿透菌丝进而侵染水稻。这些研究说明，在稻瘟病菌附着胞发育过程受到细胞周期的调节，在对稻瘟病菌与寄主植物互作过程中，为了对该病菌分生孢子当中的物质进行再利用，稻瘟病菌细胞发生自噬性的程序化死亡。
蛋白质的磷酸化与去磷酸化是生物体重普遍存在的一类重要的信号传导调节机制。通过这个过程细胞将多种胞外信号逐级放大并最终传递到细胞核内，调控一系列基因的转录，从而使生物体对外界环境的刺激做出应答。MAPK级联途径位于细胞信号传导网络的中心，参与调控细胞的生长分化新陈代谢、应答外界不良环境及病原物的侵染等多种生理过程。在对稻瘟病菌前期的研究中中，已经鉴定出同酵母FUS3/KSS1，SLT2和HOG1同源的PMK1，MPS1，OSM1 3个不同的MAPK通路[6,7]。在一些植物病原真菌中，已经对同稻瘟病菌MPS1同源的MAPK基因进行了功能分析。结果显示MAPK信号通路作为真菌致病性调节组分具有保守性。在酿酒酵母中，与细胞壁完整性(CWI)相关的MAPK信号途径是细胞对于胞内信号和外界环境条件刺激应答的重要调控手段之一[8,9,10]。CWI 信号通路的激活依赖于5个表面信号感知蛋白Wsc1，Wsc2，Wsc3，Mid2和Mtl1。在细胞受到外界的细胞壁压力刺激时，这些感受器与鸟苷酸交换因子Rom2相互作用，Rom2进而激活Rho家族的GTP酶Rho1并且将其重新释放回细胞膜上。Rho1激活蛋白激酶C(Pkc1)，后者磷酸化保守的MAP激酶串联体最上游的蛋白激酶Bck1(MAPKKK)。Bck1接着将信号传递给蛋白激酶Mkk1/Mkk2(MAPKK)，然后再传递给蛋白激酶Mpk1/Slt2(MAPK)。最后Mpk1/Slt2磷酸化转录因子Rlm1和SBF复合体(包括Swi4和Swi6)，来进一步调节细胞核中与细胞壁合成及重建和细胞周期相关的基因的表达[11] 。
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