荷花ho1基因的克隆及其在烟草中的遗传转化研究
本研究以荷花的实生苗为研究材料，克隆了荷花血红素加氧酶-1（NnHO1）基因，并进行序列结构分析，系谱树构建和三维建模，并研究了农杆菌介导法将目的基因转入烟草中的方法。结果表明，荷花的血红素加氧酶-1基因（NnHO1）编码一个含276个氨基酸的蛋白，预测该蛋白分子量约为31.75 KDa，且其N-末端含有一段长为63个氨基酸残基的信号肽序列。去除信号肽后的成熟NnHO1（mNnHO1）分子量约为24.7KDa。将NnHO1与其它植物的已知HO-1蛋白进行多序列比对，结果显示它们的HO-1蛋白具有高度同源性，其氨基酸序列具有高度保守性。我们进一步利用克隆的荷花NnHO1基因进行过表达载体构建，并通过农杆菌介导法转入烟草中，为将来验证荷花NnHO1基因功能奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言1
1材料与方法2
1.1 植物材料 2
1.2 菌株与质粒2
1.3 荷花NnHO1基因的克隆2
1.4 多序列比对和系统发育分析3
1.5 NnHO1三维结构建模3
1.6 NnHO1过表达载体构建3
1.7 农杆菌转化3
1.8 农杆菌介导的烟草遗传转化3
1.8.1 浸染用农杆菌菌液的准备3
1.8.2 外植体的获得3
1.8.3 农杆菌侵染3
1.8.4 共培养4
1.8.5 清洗外植体4
1.8.6 外植体的培养及筛选4
1.8.7 生根筛选4
2结果与分析4
2.1 荷花叶片RNA的提取结果4
2.2 荷花NnHO1基因CDS区的PCR扩增4
2.3 荷花NnHO1序列分析5
2.4 NnHO1高级结构预测7
2.5 NnHO1过表达载体构建8
2.6 农杆菌介导的遗传转化8
3讨论 9
致谢9
参考文献10
荷花HO1基因的克隆及 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
其在烟草中的遗传转化研究
引言
前言
动物上的研究表明，血红素加氧酶（heme oxygenase,HO;EC 1.14.99.3）是一种广泛存在的、敏感的、高活性的酶，以立体异构专一性的方式将血红素分解为胆绿素（BVIXα）并释放Fe2+和一氧化碳（CO）。在哺乳动物中发现，血红素加氧酶不仅在血红素降解中起到一定作用，并且作为氧化胁迫敏感性的调节器和重要的信号分子，参与并调节动物体内多种代谢途径，因此引起了广泛的研究兴趣。许多研究学者对植物中可能存在HO的研究则是模仿对哺乳动物HO的研究而展开。首先报道在红藻（Cyanidium caldarium）发现血红素加氧酶（HO）[1]。后来，Muramoto等[4]在拟南芥hy1突变体中报道了血红素加氧酶基因。目前，已从许多生物体包括哺乳动物、高等植物、crytophytas、红藻、蓝藻和病原菌中分离到血红素加氧酶基因（HOs）[24]。
对血红素加氧酶基因结构的进一步研究表明血红素加氧酶是一种具有一个由许多α螺旋组成的紧密结构域。大体上，鼠血红素加氧酶1（HO1）、HmuO、HemO、PigA和SynHO1和SynHO2[57]的晶体结构都与人类血红素加氧酶1的相似。除SynHO2外[7]，上述所有血红素加氧酶均为单体蛋白。然而，在高等植物中血红素加氧酶的结构仍未得到阐明。关于植物血红素加氧酶空间结构的唯一报道来自于Linley等[8]的研究，他们根据动物和细菌中同源的血红素加氧酶的晶体结构数据来预测豌豆血红素加氧酶1的空间结构，以此证明了它们之间结构上具有很高的保守性，尽管其一级序列的同源性十分有限。
血红素加氧酶降解血红素的机制在所有生物体中具有普遍性。不同生物体中，由于反应产物的多样性，血红素加氧酶会显示出不同的酶促特性。哺乳动物中，胆绿素还原酶将胆绿素（biliverdinIXα）还原为胆红素（BR），该酶在分泌前与葡萄糖醛酸结合。然而，在cynobacteria和藻类中，胆绿素是光合作用中用于捕获光能的藻胆素生物合成的前体[9]。在高等植物中，目前已被研究的血红素加氧酶，其作用与光敏色素生色团代谢途径有联系。胆绿素（BVIX）被还原为线性四吡咯phytochromobilin（PφB），即光受体[4]光敏色素家族中的发色团，光受体在光形态建成的光信号转导中起重要作用[10]。最近,一些报道指出血红素加氧酶（HO）还参与了植物细胞的抗氧化防护。
在哺乳动物中，体外实验表明胆绿素和胆红素都具有很强的抗氧化特性[11]，由此推测HO可能具有保护细胞免于组织损伤的作用[12]。HO及其产物BV和BR作为动植物抗氧化防护系统中的组分已得到证明[4,13]。同时，在哺乳动物细胞中，铁离子的释放和随后铁螯合蛋白如铁蛋白的诱导被认为在HO抵御胁迫环境中起重要作用[14]。但是在植物中，还未有此类的报道。现已经证实，HO1是一种可诱导酶，并且能被许多因素包括其底物血红素（haem）、一些血红素蛋白、重金属，紫外线A和B辐射、缺氧、氧胁迫等诱导表达[13,1517]。哺乳动物神经系统中HO的高水平表达，以及对CO的生理响应的证实，表明HO可专一性调节神经细胞中CO的释放，而CO被认为具有信号转导功能[18]。此外，在高等植物中，上述作用机制如BV的抗氧化特性，以及与HO催化的反应相关联的CO在细胞生理中的作用，还知之甚少，有待深入研究。
近年来对植物HO1基因方面的研究主要集中在一些模式植物上，如拟南芥（HY1）[4]、水稻（SE5）[19]、番茄（LeHO1）[3]、松树（PtHO1）[20]和豌豆（PsHO1）[8]等。因此，进一步研究HO1基因在其它植物中的功能很有必要，而且有助于深入理解植物发育和对各种胁迫反应的生理机制。本研究以荷花为研究材料，主要采用RTPCR技术，从荷花中克隆到荷花血红素加氧酶1（NnHO1）基因，并进行序列结构分析，系谱树构建和三维建模，然后研究农杆菌介导法将目的基因转入烟草中的方法，为后续获得转基因植株分析NnHO1基因的功能奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言1
1材料与方法2
1.1 植物材料 2
1.2 菌株与质粒2
1.3 荷花NnHO1基因的克隆2
1.4 多序列比对和系统发育分析3
1.5 NnHO1三维结构建模3
1.6 NnHO1过表达载体构建3
1.7 农杆菌转化3
1.8 农杆菌介导的烟草遗传转化3
1.8.1 浸染用农杆菌菌液的准备3
1.8.2 外植体的获得3
1.8.3 农杆菌侵染3
1.8.4 共培养4
1.8.5 清洗外植体4
1.8.6 外植体的培养及筛选4
1.8.7 生根筛选4
2结果与分析4
2.1 荷花叶片RNA的提取结果4
2.2 荷花NnHO1基因CDS区的PCR扩增4
2.3 荷花NnHO1序列分析5
2.4 NnHO1高级结构预测7
2.5 NnHO1过表达载体构建8
2.6 农杆菌介导的遗传转化8
3讨论 9
致谢9
参考文献10
荷花HO1基因的克隆及 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
其在烟草中的遗传转化研究
引言
前言
动物上的研究表明，血红素加氧酶（heme oxygenase,HO;EC 1.14.99.3）是一种广泛存在的、敏感的、高活性的酶，以立体异构专一性的方式将血红素分解为胆绿素（BVIXα）并释放Fe2+和一氧化碳（CO）。在哺乳动物中发现，血红素加氧酶不仅在血红素降解中起到一定作用，并且作为氧化胁迫敏感性的调节器和重要的信号分子，参与并调节动物体内多种代谢途径，因此引起了广泛的研究兴趣。许多研究学者对植物中可能存在HO的研究则是模仿对哺乳动物HO的研究而展开。首先报道在红藻（Cyanidium caldarium）发现血红素加氧酶（HO）[1]。后来，Muramoto等[4]在拟南芥hy1突变体中报道了血红素加氧酶基因。目前，已从许多生物体包括哺乳动物、高等植物、crytophytas、红藻、蓝藻和病原菌中分离到血红素加氧酶基因（HOs）[24]。
对血红素加氧酶基因结构的进一步研究表明血红素加氧酶是一种具有一个由许多α螺旋组成的紧密结构域。大体上，鼠血红素加氧酶1（HO1）、HmuO、HemO、PigA和SynHO1和SynHO2[57]的晶体结构都与人类血红素加氧酶1的相似。除SynHO2外[7]，上述所有血红素加氧酶均为单体蛋白。然而，在高等植物中血红素加氧酶的结构仍未得到阐明。关于植物血红素加氧酶空间结构的唯一报道来自于Linley等[8]的研究，他们根据动物和细菌中同源的血红素加氧酶的晶体结构数据来预测豌豆血红素加氧酶1的空间结构，以此证明了它们之间结构上具有很高的保守性，尽管其一级序列的同源性十分有限。
血红素加氧酶降解血红素的机制在所有生物体中具有普遍性。不同生物体中，由于反应产物的多样性，血红素加氧酶会显示出不同的酶促特性。哺乳动物中，胆绿素还原酶将胆绿素（biliverdinIXα）还原为胆红素（BR），该酶在分泌前与葡萄糖醛酸结合。然而，在cynobacteria和藻类中，胆绿素是光合作用中用于捕获光能的藻胆素生物合成的前体[9]。在高等植物中，目前已被研究的血红素加氧酶，其作用与光敏色素生色团代谢途径有联系。胆绿素（BVIX）被还原为线性四吡咯phytochromobilin（PφB），即光受体[4]光敏色素家族中的发色团，光受体在光形态建成的光信号转导中起重要作用[10]。最近,一些报道指出血红素加氧酶（HO）还参与了植物细胞的抗氧化防护。
在哺乳动物中，体外实验表明胆绿素和胆红素都具有很强的抗氧化特性[11]，由此推测HO可能具有保护细胞免于组织损伤的作用[12]。HO及其产物BV和BR作为动植物抗氧化防护系统中的组分已得到证明[4,13]。同时，在哺乳动物细胞中，铁离子的释放和随后铁螯合蛋白如铁蛋白的诱导被认为在HO抵御胁迫环境中起重要作用[14]。但是在植物中，还未有此类的报道。现已经证实，HO1是一种可诱导酶，并且能被许多因素包括其底物血红素（haem）、一些血红素蛋白、重金属，紫外线A和B辐射、缺氧、氧胁迫等诱导表达[13,1517]。哺乳动物神经系统中HO的高水平表达，以及对CO的生理响应的证实，表明HO可专一性调节神经细胞中CO的释放，而CO被认为具有信号转导功能[18]。此外，在高等植物中，上述作用机制如BV的抗氧化特性，以及与HO催化的反应相关联的CO在细胞生理中的作用，还知之甚少，有待深入研究。
近年来对植物HO1基因方面的研究主要集中在一些模式植物上，如拟南芥（HY1）[4]、水稻（SE5）[19]、番茄（LeHO1）[3]、松树（PtHO1）[20]和豌豆（PsHO1）[8]等。因此，进一步研究HO1基因在其它植物中的功能很有必要，而且有助于深入理解植物发育和对各种胁迫反应的生理机制。本研究以荷花为研究材料，主要采用RTPCR技术，从荷花中克隆到荷花血红素加氧酶1（NnHO1）基因，并进行序列结构分析，系谱树构建和三维建模，然后研究农杆菌介导法将目的基因转入烟草中的方法，为后续获得转基因植株分析NnHO1基因的功能奠定基础。
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