甜菜夜蛾细胞色素b5还原酶的克隆和序列分析
NADH-细胞色素b5还原酶(CbR)属于黄素蛋白和多功能氧化酶，在各种生理反应中传递电子到基质复合物中，比如细胞色素P450s代谢反应，和脂肪酰基辅酶的去饱和以及延伸等，并可能运用于食品工业、生物传感器和诊断等领域。在这个实验中，有不同N-末端核苷酸序列的两个SeCbR基因的cDNA全长，是独立的基因。克隆体SeCbR1(SeCbR-like3)和SeCbR2(SeCbR-like2)有完整的公开阅读框，分别预测性地编码324氨基酸和311氨基酸，以及其在其他几个物种中与CbRs拥有高度的特异性。由于SeCbR1和SeCbR2 更多信息的逐步公开，两基因可以通过生物信息软件分析和RT-qPCR方法检测。这两个基因在N-末端都拥有跨膜区。而且系统发育树结果表明这两个基因是属于CbR家系并与棉铃虫CbR关系最为亲切。RT-qPCR结果显示，SeCbR1和SeCbR2在除了卵期的大多数发育阶段中甜菜夜蛾的角质层组织、脂肪体和中肠中表达。在SeCbR1和SeCbR2基因上的最初发现能够为在分子水平上为进一步学习它们打好基础。
目录
摘要 1
引言 1
1. 材料与方法 2
1.1 甜菜夜蛾的饲养方法 2
1.2 饲养结果 2
1.2.1 人工饲养 2
1.2.2 累代饲养 3
1.3 RNA提取 3
1.3.1 RNA提取步骤 3
1.4 总RNA分离和cDNA合成 3
1.4.1 SeCbR的全长cDNA克隆 3
1.4.2 序列分析 4
1.4.3 RTqPCR分析 4
2. 结果与讨论 4
2.1 SeCbR的克隆和序列分析 4
2.1.1 SeCbR的系统分析 8
2.1.2 在甜菜夜蛾中SeCbR1和SeCbR2的mRNA表达水平 9
3. 讨论 10
致谢 11
参考文献 11
甜菜夜蛾细胞色素b5还原酶的克隆和序列分析
引言
甜菜夜蛾(Beet armyworm )学名(Spodoptera exigua Hubner)，俗称白菜 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
褐夜蛾，属于鳞翅目夜蛾科，是一种世界性分布、间歇性发生的以危害蔬菜为主的杂食性害虫。对大葱、甘蓝、大白菜、芹菜、菜花、胡萝卜、芦笋、蕹菜、苋菜、辣椒、豇豆、花椰菜、茄子、芥兰、番茄、小白菜、青花菜、菠菜、萝卜等蔬菜都有危害。其中，甜菜夜蛾幼
虫对生姜的危害最强[12]。幼虫主要取食生姜的叶片，将叶片吃成空洞或缺剂，严重时整个叶片被咬食殆尽，只剩叶脉和叶柄，导致植株死亡，缺苗断垄，影响到作物的产量和品质。甜菜夜蛾的突发性、强扩散能力、幼虫的昼伏夜出习性以及高抗药性都给防治带来了极大困难[3]。利用信息素技术诱导防治两种害虫的方法己在国内外得到了应用[4]。但鉴于两种害虫都是雌雄多次交配型，采用大量诱捕法必须诱杀掉很高比例的雄蛾，才能有效抑制雌蛾的交配并降低下一代的种群发生量，这在害虫种群密度较高时实现第一时间的防治显得尤为困难。国外多采用交配干扰法，其效果较好，但成本较高，限制了该技术的推广应用。
细胞色素b5 蛋白(Cytb5)，作为执行电子传递功能的媒介，在生物体内最重要的是与其相互作用的细胞色素b5还原酶(cytochrome b5 reductase,Cytb5R)；后者催化两电子从还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide reduced form)到两分子的Cytb5晶体结构(蛋白数据库编码1IBO)。有数据显示，Cytb5R具有两个结构域，在其N端和C端区域分别结合有黄素腺嘌呤二核苷酸FAD (flavin adenine dinucleotide)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH[5]。Cytb5也叫黄素蛋白，是一种多功能氧化还原酶。它作为生物体解毒的主要代谢体系，可以对生物体的内源和外源化合物起到氧化还原，降解代谢的作用，是甜菜夜蛾等害虫对杀虫剂产生抗药性的主要机制之一。它能与受体结合参与多种反应，比如P450s新陈代谢反应，脂肪酰基辅酶的延伸和去饱和等，并且在食品行业、传感器和诊断领域有所应用。目前，Cytb5已从真菌，植物，哺乳动物中提取到并且已经做了更深入的研究，但是在昆虫中对于Cytb5的研究，只有在地中海实蝇、家蝇、棉铃虫中取得了一定的研究进展，在其他昆虫中仍较少报道。另外虽然Cytb5和Cytb5R的晶体结构都得到了很好的解析，但到目前为止，仍缺乏关于Cytb5Cytb5R复合物晶体结构的研究报道。
1.材料与方法
1.1甜菜夜蛾的饲养方法
(1) 虫卵收集。
成虫放入笼后，第2天即产卵，卵的收集用塑料纸固定在笼内壁上，次日收集卵纸，将卵块取下放入培养皿内加湿棉球保湿。
(2) 幼虫的饲养。
卵在(27±1)℃的条件下2天孵化，在前一天要将卵移入养虫缸中，缸内加饲料，用黑布盖缸口，用橡皮筋扎紧后在日光灯下光照(14h光照：10h黑暗)。根据饲养情况及时更换饲料，幼虫龄后食量剧增，须每天更换饲料，甜菜夜蛾幼虫体色发亮时要及时拌沙土让其化蛹，3天后可将蛹从沙土中取出，放入果酱瓶内（瓶底部需放吸水纸保湿）。
(3) 成虫的收集。
成虫羽化后要及时移入笼内，并除去畸形蛾子。配蛾笼外部要用湿纱布保湿，湿度应保持在80%～90%左右，光照周期为14h光照和10h黑暗，成虫喂洋槐蜂蜜水。
(4) 病毒预防。
为防止病毒感染，每月需用紫外线消毒一次，每次30min。幼虫期间用具需用酒精消毒，若发现病毒污染，应全部销毁，以免传染其它虫源，造成更大损失。
1.2饲养结果
1.2.1人工饲养。
人工饲料饲养的甜菜夜蛾发育历期(采用本方法在实验室饲养甜菜夜蛾，在本饲养条件下)：1个世代的历期为2428天；各虫态历期分别为：卵期为2天，1～3龄幼虫期为7～8天，4～5天龄幼虫期为3～4天，蛹期为7天，产卵前期2天，产卵期4～5天。
1.2.2累代饲养。
累代饲养8代结果(用人工饲料连续饲养8代)：饲养效果较理想，平均蛹重达112.9mg；化蛹率、羽化率均在90%以上。[化蛹率达97%(化蛹率=有效蛹数/试验虫数×100%)，羽化率达91.3%(羽化率=有效蛾数/试验蛹数×100%)]。
1.3 RNA提取
采用变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，沉淀、洗涤、晾干、最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即样品细胞或组织的有效破碎、使核蛋白复合体的有效变性、对内源RNA酶的有效抑制、将RNA从DNA和蛋白混合物的有效分离。对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径：提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法已经很少使用了。
目录
摘要 1
引言 1
1. 材料与方法 2
1.1 甜菜夜蛾的饲养方法 2
1.2 饲养结果 2
1.2.1 人工饲养 2
1.2.2 累代饲养 3
1.3 RNA提取 3
1.3.1 RNA提取步骤 3
1.4 总RNA分离和cDNA合成 3
1.4.1 SeCbR的全长cDNA克隆 3
1.4.2 序列分析 4
1.4.3 RTqPCR分析 4
2. 结果与讨论 4
2.1 SeCbR的克隆和序列分析 4
2.1.1 SeCbR的系统分析 8
2.1.2 在甜菜夜蛾中SeCbR1和SeCbR2的mRNA表达水平 9
3. 讨论 10
致谢 11
参考文献 11
甜菜夜蛾细胞色素b5还原酶的克隆和序列分析
引言
甜菜夜蛾(Beet armyworm )学名(Spodoptera exigua Hubner)，俗称白菜 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
褐夜蛾，属于鳞翅目夜蛾科，是一种世界性分布、间歇性发生的以危害蔬菜为主的杂食性害虫。对大葱、甘蓝、大白菜、芹菜、菜花、胡萝卜、芦笋、蕹菜、苋菜、辣椒、豇豆、花椰菜、茄子、芥兰、番茄、小白菜、青花菜、菠菜、萝卜等蔬菜都有危害。其中，甜菜夜蛾幼
虫对生姜的危害最强[12]。幼虫主要取食生姜的叶片，将叶片吃成空洞或缺剂，严重时整个叶片被咬食殆尽，只剩叶脉和叶柄，导致植株死亡，缺苗断垄，影响到作物的产量和品质。甜菜夜蛾的突发性、强扩散能力、幼虫的昼伏夜出习性以及高抗药性都给防治带来了极大困难[3]。利用信息素技术诱导防治两种害虫的方法己在国内外得到了应用[4]。但鉴于两种害虫都是雌雄多次交配型，采用大量诱捕法必须诱杀掉很高比例的雄蛾，才能有效抑制雌蛾的交配并降低下一代的种群发生量，这在害虫种群密度较高时实现第一时间的防治显得尤为困难。国外多采用交配干扰法，其效果较好，但成本较高，限制了该技术的推广应用。
细胞色素b5 蛋白(Cytb5)，作为执行电子传递功能的媒介，在生物体内最重要的是与其相互作用的细胞色素b5还原酶(cytochrome b5 reductase,Cytb5R)；后者催化两电子从还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide reduced form)到两分子的Cytb5晶体结构(蛋白数据库编码1IBO)。有数据显示，Cytb5R具有两个结构域，在其N端和C端区域分别结合有黄素腺嘌呤二核苷酸FAD (flavin adenine dinucleotide)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH[5]。Cytb5也叫黄素蛋白，是一种多功能氧化还原酶。它作为生物体解毒的主要代谢体系，可以对生物体的内源和外源化合物起到氧化还原，降解代谢的作用，是甜菜夜蛾等害虫对杀虫剂产生抗药性的主要机制之一。它能与受体结合参与多种反应，比如P450s新陈代谢反应，脂肪酰基辅酶的延伸和去饱和等，并且在食品行业、传感器和诊断领域有所应用。目前，Cytb5已从真菌，植物，哺乳动物中提取到并且已经做了更深入的研究，但是在昆虫中对于Cytb5的研究，只有在地中海实蝇、家蝇、棉铃虫中取得了一定的研究进展，在其他昆虫中仍较少报道。另外虽然Cytb5和Cytb5R的晶体结构都得到了很好的解析，但到目前为止，仍缺乏关于Cytb5Cytb5R复合物晶体结构的研究报道。
1.材料与方法
1.1甜菜夜蛾的饲养方法
(1) 虫卵收集。
成虫放入笼后，第2天即产卵，卵的收集用塑料纸固定在笼内壁上，次日收集卵纸，将卵块取下放入培养皿内加湿棉球保湿。
(2) 幼虫的饲养。
卵在(27±1)℃的条件下2天孵化，在前一天要将卵移入养虫缸中，缸内加饲料，用黑布盖缸口，用橡皮筋扎紧后在日光灯下光照(14h光照：10h黑暗)。根据饲养情况及时更换饲料，幼虫龄后食量剧增，须每天更换饲料，甜菜夜蛾幼虫体色发亮时要及时拌沙土让其化蛹，3天后可将蛹从沙土中取出，放入果酱瓶内（瓶底部需放吸水纸保湿）。
(3) 成虫的收集。
成虫羽化后要及时移入笼内，并除去畸形蛾子。配蛾笼外部要用湿纱布保湿，湿度应保持在80%～90%左右，光照周期为14h光照和10h黑暗，成虫喂洋槐蜂蜜水。
(4) 病毒预防。
为防止病毒感染，每月需用紫外线消毒一次，每次30min。幼虫期间用具需用酒精消毒，若发现病毒污染，应全部销毁，以免传染其它虫源，造成更大损失。
1.2饲养结果
1.2.1人工饲养。
人工饲料饲养的甜菜夜蛾发育历期(采用本方法在实验室饲养甜菜夜蛾，在本饲养条件下)：1个世代的历期为2428天；各虫态历期分别为：卵期为2天，1～3龄幼虫期为7～8天，4～5天龄幼虫期为3～4天，蛹期为7天，产卵前期2天，产卵期4～5天。
1.2.2累代饲养。
累代饲养8代结果(用人工饲料连续饲养8代)：饲养效果较理想，平均蛹重达112.9mg；化蛹率、羽化率均在90%以上。[化蛹率达97%(化蛹率=有效蛹数/试验虫数×100%)，羽化率达91.3%(羽化率=有效蛾数/试验蛹数×100%)]。
1.3 RNA提取
采用变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，沉淀、洗涤、晾干、最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即样品细胞或组织的有效破碎、使核蛋白复合体的有效变性、对内源RNA酶的有效抑制、将RNA从DNA和蛋白混合物的有效分离。对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径：提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法已经很少使用了。
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