辣椒疫霉效应因子rxlr103在致病中的功能初步研究
摘要：疫霉菌可以分泌大量的效应因子干扰寄主植物的防卫反应，从而促进其侵染。然而，我们目前对绝大多数疫霉菌效应因子的功能和作用机制还知之甚少。RxLR效应因子是一类胞内效应因子，这类效应因子从病原菌分泌到细胞外后可以转运进入寄主植物细胞。本研究从辣椒疫霉菌中成功克隆了10个RxLR效应因子，并将其构建到病毒表达载体PVX。利用农杆菌介导的植物瞬时表达系统，在本氏烟叶片中分别瞬时表达这10个效应因子后再接种辣椒疫霉菌，获得了一个能够显著促进疫霉菌侵染的效应因子RxLR103。实时定量PCR分析结果表明RxLR103在侵染阶段上调表达，表明其在侵染过程中可能发挥重要作用。亚细胞定位结果表明RxLR103定位于植物的细胞质和细胞核。细胞死亡诱导实验结果显示RxLR103可以诱导微弱的植物细胞死亡，然而该细胞死亡诱导活性与促进病原菌侵染的毒性功能之间的关系尚不明确。本研究为进一步认识RxLR103的作用机制奠定了基础，并为认识疫霉菌的致病机制提供线索。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言2
1材料与方法3
1.1材料3
1.1.1供试菌株3
1.1.2供试植物3
1.1.3试验用培养基3
1.2方法3
1.2.1大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备3
1.2.2农杆菌GV3101感受态细胞制备3
1.2.3载体构建和验证4
1.2.4 RxLR效应因子的功能筛选5
1.2.5 表达模式分析6
1.2.6 亚细胞定位观察7
2结果与分析7
2.1在本氏烟中表达RxLR103能够促进辣椒疫霉菌的侵染7
2.2 RxLR103在侵染阶段诱导表达8
2.3 RxLR103能够在本氏烟叶片中诱导细胞死亡9
2.4 RxLR103蛋白在本氏烟细胞质和细胞核均有分布9
3讨论10
致谢10
参考文献11
辣椒疫霉效应因子RxLR103在致病中的功能初步研究
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
卵菌（Oomycetes）包括许多重要的植物病原菌，可引起发毁灭性的植物病害，目前鉴定到的120多个疫霉种均可以造成重要的植物病害。卵菌引起的重要植物病害如马铃薯晚疫病、瓜菜类霜霉病、烟草黑胫病等，在世界范围内造成巨大的经济损失。辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）可侵染辣椒与黄瓜等上百种蔬菜，近年来造成了巨大的经济损失，并且它还可以侵染模式植物拟南芥和本氏烟，已经成为卵菌研究的重要模式种[1,2]。由于卵菌对农业生产和生态环境造成的巨大危害，加上卵菌独特的进化地位，积极推动了卵菌基因组测序的进展。目前已经有超过十个卵菌的全基因组完成测序，包括疫霉菌属的致病疫霉菌（P. infestans）[3]、大豆疫霉菌（P. sojae）[4]、橡树疫霉菌（P. ramorum）[4]、辣椒疫霉菌（P.capsici）[5]，水霉属的寄生水霉菌（Saprolegnia parasitica）[6]，霜霉属的寄生霜霉菌（Peronospora parasitica）[7]，白锈属的白锈菌（Albugo laibachii）[8]和腐霉属的终极腐霉菌（Pythium ultimum）[9]等。
效应因子是一类病原菌分泌的蛋白质，它们在寄主细胞外或进入植物细胞干扰寄主植物细胞的生理和功能，干扰植物的防卫反应[10]。基因组序列分析表明，卵菌基因组编码大量的效应因子[3,4]。卵菌效应因子中比较独特一类叫做RxLR（R，精氨酸；x，任意氨基酸；L，亮氨酸；R，精氨酸）效应因子，其蛋白氮端含有约20个左右氨基酸残基的信号肽序列，随后在4090个氨基酸的位置有一个RxLR保守基序，该基序负责将效应因子蛋白转运进入植物细胞。有趣的是RxLR蛋白基序可以在不依赖病原菌的情况下介导效应因子进入植物细胞[11,12]。在致病疫霉菌基因组中约含有563个RxLR效应因子基因[3]，在大豆疫霉菌、橡树疫霉菌、寄生霜霉菌和白锈菌等中均鉴定到了大量的RxLR效应因子[4,7,8]，但在终极腐霉菌中未发现RxLR效应因子的同源物[9]，表明RxLR效应因子可能主要在专性活体营养类型的的病原菌中发挥作用。
当寄主植物中含有与之对应的抗病蛋白（resistance protein，R）时，效应因子会触发植物的防卫反应（effectortriggered immunity，ETI），此时的效应因子又被称为无毒蛋白（avirulence protein，AVR）[13]。目前卵菌中鉴定到的无毒蛋白几乎全部为RxLR效应因子[14]。例如，大豆疫霉菌的PsAvr1a, PsAvr1b, PsAvr1d, PsAvr1k, PsAvr3a/5, PsAvr3b, PsAvr3c,和PsAvr4/6; 致病疫霉菌的PiAvr1，PiAvr2，PiAvr3a，PiAvr3b，PiAvrBlb1，PiAvrBlb2和PiAvrVnt1；寄生霜霉菌的HaATR1，HaATR13和HaATR39[14,15]。而当寄主植物中不含有与之对应的抗病蛋白时，效应因子往往会表现出毒性功能，抑制植物的免疫反应，从而促进病原菌的侵染。近年来已经揭示了数个RxLR效应子具有促进病原菌侵染的毒性功能。例如，致病疫霉菌PiAvrblb1可以与植物的凝集素受体激酶LecRKI.9互作，干扰植物的防卫反应[16]；致病疫霉菌PiAvrblb2可以阻断寄主植物半胱氨酸蛋白酶C14的分泌，使寄主植物感病[17]；致病疫霉菌的RxLR效应子Pi03192可以通过阻止寄主植物中两个NAC转录因子的重定位来抑制植物的防卫反应[18]；大豆疫霉菌中的PsAvr3b具有Nudix水解酶的生化活性[19]，且发现该生化活性是其发挥毒性功能必需的[19]。然而，我们目前对绝大多数效应因子的毒性功能及作用机制尚不明确。
前人的研究结果表明疫霉菌RxLR效应因子具有调控植物细胞死亡的功能[20,21]。绝大多数疫霉菌属于半活体营养（hemibiotrophic），在疫霉菌侵染植物早期，疫霉菌分泌效应因子抑制寄主的细胞死亡，促进病原菌的侵染；而在疫霉菌侵染后期，病原菌分泌效应因子杀死寄主植物，从而帮助病原菌过渡到死体营养（necrotrophic）阶段。病原菌可能通过调控效应因子的顺序表达实现了其营养类型的转换[22]。然而我们对调节的具体机制还知之甚少。致病疫霉菌通过在侵染早期分泌SNE1效应因子，抑制寄主植物的细胞程序化死亡，从而促进病原菌的侵染[23]。大豆疫霉菌Avh241定位在植物细胞膜，可以诱导植物的细胞死亡[24]，然而其是否在病原菌过渡到死体营养过程中发挥作用尚不明确。
本研究利用辣椒疫霉菌本氏烟模式病害系统，首先从辣椒疫霉菌中克隆了10个表达量较高的RxLR效应因子，接着利用农杆菌介导的植物瞬时表达技术和接种分析技术，鉴定到一个能够明显促进疫霉菌侵染的效应因子RxLR103。进一步通过表达模式分析、亚细胞等位观察、细胞死亡诱导等分析，初步明确了RxLR103的毒性功能，为进一步研究RxLR103的作用机制奠定了基础，为认识疫霉菌的致病机制提供了线索。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101为本实验室保存。辣椒疫霉（Phytophthora capsici）菌株LT263为王源超教授馈赠。辣椒疫霉菌在10%的V8固体培养基，25℃、黑暗条件培养。
1.1.2供试植物
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言2
1材料与方法3
1.1材料3
1.1.1供试菌株3
1.1.2供试植物3
1.1.3试验用培养基3
1.2方法3
1.2.1大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备3
1.2.2农杆菌GV3101感受态细胞制备3
1.2.3载体构建和验证4
1.2.4 RxLR效应因子的功能筛选5
1.2.5 表达模式分析6
1.2.6 亚细胞定位观察7
2结果与分析7
2.1在本氏烟中表达RxLR103能够促进辣椒疫霉菌的侵染7
2.2 RxLR103在侵染阶段诱导表达8
2.3 RxLR103能够在本氏烟叶片中诱导细胞死亡9
2.4 RxLR103蛋白在本氏烟细胞质和细胞核均有分布9
3讨论10
致谢10
参考文献11
辣椒疫霉效应因子RxLR103在致病中的功能初步研究
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
卵菌（Oomycetes）包括许多重要的植物病原菌，可引起发毁灭性的植物病害，目前鉴定到的120多个疫霉种均可以造成重要的植物病害。卵菌引起的重要植物病害如马铃薯晚疫病、瓜菜类霜霉病、烟草黑胫病等，在世界范围内造成巨大的经济损失。辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）可侵染辣椒与黄瓜等上百种蔬菜，近年来造成了巨大的经济损失，并且它还可以侵染模式植物拟南芥和本氏烟，已经成为卵菌研究的重要模式种[1,2]。由于卵菌对农业生产和生态环境造成的巨大危害，加上卵菌独特的进化地位，积极推动了卵菌基因组测序的进展。目前已经有超过十个卵菌的全基因组完成测序，包括疫霉菌属的致病疫霉菌（P. infestans）[3]、大豆疫霉菌（P. sojae）[4]、橡树疫霉菌（P. ramorum）[4]、辣椒疫霉菌（P.capsici）[5]，水霉属的寄生水霉菌（Saprolegnia parasitica）[6]，霜霉属的寄生霜霉菌（Peronospora parasitica）[7]，白锈属的白锈菌（Albugo laibachii）[8]和腐霉属的终极腐霉菌（Pythium ultimum）[9]等。
效应因子是一类病原菌分泌的蛋白质，它们在寄主细胞外或进入植物细胞干扰寄主植物细胞的生理和功能，干扰植物的防卫反应[10]。基因组序列分析表明，卵菌基因组编码大量的效应因子[3,4]。卵菌效应因子中比较独特一类叫做RxLR（R，精氨酸；x，任意氨基酸；L，亮氨酸；R，精氨酸）效应因子，其蛋白氮端含有约20个左右氨基酸残基的信号肽序列，随后在4090个氨基酸的位置有一个RxLR保守基序，该基序负责将效应因子蛋白转运进入植物细胞。有趣的是RxLR蛋白基序可以在不依赖病原菌的情况下介导效应因子进入植物细胞[11,12]。在致病疫霉菌基因组中约含有563个RxLR效应因子基因[3]，在大豆疫霉菌、橡树疫霉菌、寄生霜霉菌和白锈菌等中均鉴定到了大量的RxLR效应因子[4,7,8]，但在终极腐霉菌中未发现RxLR效应因子的同源物[9]，表明RxLR效应因子可能主要在专性活体营养类型的的病原菌中发挥作用。
当寄主植物中含有与之对应的抗病蛋白（resistance protein，R）时，效应因子会触发植物的防卫反应（effectortriggered immunity，ETI），此时的效应因子又被称为无毒蛋白（avirulence protein，AVR）[13]。目前卵菌中鉴定到的无毒蛋白几乎全部为RxLR效应因子[14]。例如，大豆疫霉菌的PsAvr1a, PsAvr1b, PsAvr1d, PsAvr1k, PsAvr3a/5, PsAvr3b, PsAvr3c,和PsAvr4/6; 致病疫霉菌的PiAvr1，PiAvr2，PiAvr3a，PiAvr3b，PiAvrBlb1，PiAvrBlb2和PiAvrVnt1；寄生霜霉菌的HaATR1，HaATR13和HaATR39[14,15]。而当寄主植物中不含有与之对应的抗病蛋白时，效应因子往往会表现出毒性功能，抑制植物的免疫反应，从而促进病原菌的侵染。近年来已经揭示了数个RxLR效应子具有促进病原菌侵染的毒性功能。例如，致病疫霉菌PiAvrblb1可以与植物的凝集素受体激酶LecRKI.9互作，干扰植物的防卫反应[16]；致病疫霉菌PiAvrblb2可以阻断寄主植物半胱氨酸蛋白酶C14的分泌，使寄主植物感病[17]；致病疫霉菌的RxLR效应子Pi03192可以通过阻止寄主植物中两个NAC转录因子的重定位来抑制植物的防卫反应[18]；大豆疫霉菌中的PsAvr3b具有Nudix水解酶的生化活性[19]，且发现该生化活性是其发挥毒性功能必需的[19]。然而，我们目前对绝大多数效应因子的毒性功能及作用机制尚不明确。
前人的研究结果表明疫霉菌RxLR效应因子具有调控植物细胞死亡的功能[20,21]。绝大多数疫霉菌属于半活体营养（hemibiotrophic），在疫霉菌侵染植物早期，疫霉菌分泌效应因子抑制寄主的细胞死亡，促进病原菌的侵染；而在疫霉菌侵染后期，病原菌分泌效应因子杀死寄主植物，从而帮助病原菌过渡到死体营养（necrotrophic）阶段。病原菌可能通过调控效应因子的顺序表达实现了其营养类型的转换[22]。然而我们对调节的具体机制还知之甚少。致病疫霉菌通过在侵染早期分泌SNE1效应因子，抑制寄主植物的细胞程序化死亡，从而促进病原菌的侵染[23]。大豆疫霉菌Avh241定位在植物细胞膜，可以诱导植物的细胞死亡[24]，然而其是否在病原菌过渡到死体营养过程中发挥作用尚不明确。
本研究利用辣椒疫霉菌本氏烟模式病害系统，首先从辣椒疫霉菌中克隆了10个表达量较高的RxLR效应因子，接着利用农杆菌介导的植物瞬时表达技术和接种分析技术，鉴定到一个能够明显促进疫霉菌侵染的效应因子RxLR103。进一步通过表达模式分析、亚细胞等位观察、细胞死亡诱导等分析，初步明确了RxLR103的毒性功能，为进一步研究RxLR103的作用机制奠定了基础，为认识疫霉菌的致病机制提供了线索。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101为本实验室保存。辣椒疫霉（Phytophthora capsici）菌株LT263为王源超教授馈赠。辣椒疫霉菌在10%的V8固体培养基，25℃、黑暗条件培养。
1.1.2供试植物
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