过表达大豆gmdof11基因t2代植株的转基因检测和农艺性状考察
大豆是世界上重要的粮食和油料作物，也是植食性蛋白质的重要来源，然而目前中国大豆生产总量还远远不能满足国内对大豆消费需求。随着基因工程研究的深入，用转基因技术来改良品种已在许多作物上得到应用。在植物的生长和发育过程中，Dof蛋白作为转录的激活子或抑制子起到了重要的作用。本实验通过将大豆种子发育和储藏物质形成相关的基因GmDof11在大豆品种Jack中过表达，得到的抗性植株后代进行分子检测和农艺性状调查。GmDof11基因对蛋白质含量和油分含量影响显著,但对株高、主茎节数、单株荚数、单株种子数、单株产量和百粒重没有显著的影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1 DNA提取2
1.2.2 PCR鉴定3
1.2.3 RNA提取和cDNA合成3
1.2.4 RTPCR4
1.2.5 农艺性状调查5
1.2.6 蛋白和油分含量测定5
2结果与分析5
2.1基因组DNA的提取和质量5
2.2 T2代植株的PCR检测 5
2.3 RNA提取和RTPCR6
2.3.1 RNA提取和质量检测6
2.3.2 RTPCR 6
2.4转基因株系的农艺性状调查 7
2.5转基因株系的蛋白和油份含量测定 8
3讨论 9
致谢9
参考文献11
图1部分被检测样品基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图5
图2部分被检测样品目的基因PCR结果琼脂糖凝胶电泳图6
图3转基因和对照植株总RNA提取结果琼脂糖凝胶电泳图6
图4各株系GmDof11基因的相对表达量 7
图5 转基因株系和WT农艺性状的描述性统计8
图6转基因株系的蛋白和油份含量测定9
过表达大豆GmDof11基因T2代植株的转基因检测和农艺性状考察
引言
引言 大豆不仅是世界
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
上重要的粮食及油料作物，还是植食性蛋白质的重要来源，然而目前中国的大豆生产总量还远远不能满足国内对大豆的消费需求，现今我国市面上油用的大豆大多还是依赖于进口的大豆，特别是从美国进口的转基因大豆。虽然多年来通过遗传改良的方法，已经获得一些高产、高油分、高蛋白的优良品种，但要获得持续高产高营养价值的大豆新品种，还存在很多局限。随着对基因工程持续深入的研究，用转基因技术来改良品种已在许多作物上得到应用[1]。通过转基因技术同时配合传统育种方法，来进行提高大豆的产量和品质已经成为一种新的有效途径。在美国转基因大豆充斥中国市场的情况下，培育高产优质的自主大豆品种，已成为我国大豆育种的迫切任务，也是发展可持续农业的重要课题。
大豆是油料作物中最重要的豆科作物之一，研究发现在调控大豆的油脂含量中Dof蛋白也是发挥了重要的作用。Dof(DNA binding with one finger)蛋白是一类转录因子，并且是植物所特有的，目前还没有在果蝇、美丽线虫和酿酒酵母的基因组中发现存在Dof基因[2]。而Dof蛋白中有一个特别的富含Cys残基的单锌指保守结构域[3]，命名为Dof结构域。迄今为止，已在多种单子叶植物及双子叶植物中发现了Dof蛋白的存在[414]。Dof蛋白都仅仅含有一个拷贝的Dof保守域，通常情况下，是有2个主要的结构域来构成的，分别是位于N=末端的DNA结合高度保守结合域以及位于C=末端的转录调控域[15]。同时，因为转录调控结构域位于Dof蛋白C=末端, 而且其氨基酸序列是较为多变的，并不具有保守性, 这也导致了在植物中Dof蛋白的功能多样性[16]。而对Dof家族成员进行系统分类的依据，则是拟南芥的全基因组序列预测的Dof基因[17]，以及来自玉米、大麦、小麦、烟草和水稻等的部分Dof成员进行的[18]，而且从进化树[16]分析的结果我们可以发现，把这些Dof成员进行分类，能够分成7个不同的亚群，而且除了Dof保守域作为分类依据，存在于亚群中的其他的保守氨基酸，也可以为Dof家族成员的系统分类提供了辅助的分类信息[19]。
很多在体内外结合实验都可以说明，当Dof蛋白中的Dof结构域在与不同的植物基因启动子的DNA相结合时，具有特异性。同时，Dof蛋白与其他的锌指蛋白一样，它也是一个有双功能的结构域，即还具有蛋白蛋白互作的功能。因为Dof蛋白结合元件在很多种植物的特异性的启动子中都被发现了，而且由于Dof蛋白还具有蛋白蛋白互作的功能, 所以众多的研究证明：在植物生长和发育的过程中，Dof转录因子还参与多种生物学过程，比如碳氮代谢、光响应、花和花粉发育、种子发育和萌发、次生代谢、保卫细胞特异基因的调控、维管发育和叶片极性等[2027]。
植物中存在一些调控种子发育和种子储藏成分相关的基因，通过在大豆中表达或过表达这类基因，有希望获得产量和油分、蛋白等有效成分更高的大豆新材料，以满足育种和市场的需求。本实验通过将GmDof11基因转入大豆，对遗传转化中的抗性苗进行分子鉴定从而获得阳性植株，并对鉴定得到的阳性苗进行初步的生物学观测和生理指标测定，期望得到产量、品质有所改良的大豆新材料。
1材料与方法
1．1 材料
通过农杆菌介导大豆子叶节转化的方法得到转GmDof11基因大豆材料T0代。T2代2015年6月种于江浦网室，V3期以后取叶片用于提取DNA和RNA进行检测。
1．2 方法
1．2．1 DNA提取
用新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根）提取叶片DNA，具体的操作如下：
（1）取100mg转GmDof11基因T1代大豆植株V3期以后的叶片，把它放进洁净的研钵里，加入液氮后将叶片其进行充分的研磨，使其变成粉末状，再转移到离心管中，加入500μl缓冲液LP1和6μl RNaseA，涡旋振荡1min，室温静置10min；
（2）加入缓冲液LP2到离心管里，盖上管盖，上下摇荡使其得以充分混匀，涡旋1min；
（3）把涡旋后的离心管取出，再把其放入离心机中，以12000rpm离心5min，吸取上清，然后转入新的离心管里；
（4）加入1.5倍体积的缓冲液LP3（这里要确定加入了乙醇），立即上下振荡使其得以混匀15sec，注意此时可能会出现絮状沉淀；
（5）把（4）中得到的溶液以及絮状沉淀，全部加入到吸附柱CB3中去，并把其放进相互配套的收集管中，再以12000rpm离心30sec，弃废液；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1 DNA提取2
1.2.2 PCR鉴定3
1.2.3 RNA提取和cDNA合成3
1.2.4 RTPCR4
1.2.5 农艺性状调查5
1.2.6 蛋白和油分含量测定5
2结果与分析5
2.1基因组DNA的提取和质量5
2.2 T2代植株的PCR检测 5
2.3 RNA提取和RTPCR6
2.3.1 RNA提取和质量检测6
2.3.2 RTPCR 6
2.4转基因株系的农艺性状调查 7
2.5转基因株系的蛋白和油份含量测定 8
3讨论 9
致谢9
参考文献11
图1部分被检测样品基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图5
图2部分被检测样品目的基因PCR结果琼脂糖凝胶电泳图6
图3转基因和对照植株总RNA提取结果琼脂糖凝胶电泳图6
图4各株系GmDof11基因的相对表达量 7
图5 转基因株系和WT农艺性状的描述性统计8
图6转基因株系的蛋白和油份含量测定9
过表达大豆GmDof11基因T2代植株的转基因检测和农艺性状考察
引言
引言 大豆不仅是世界
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
上重要的粮食及油料作物，还是植食性蛋白质的重要来源，然而目前中国的大豆生产总量还远远不能满足国内对大豆的消费需求，现今我国市面上油用的大豆大多还是依赖于进口的大豆，特别是从美国进口的转基因大豆。虽然多年来通过遗传改良的方法，已经获得一些高产、高油分、高蛋白的优良品种，但要获得持续高产高营养价值的大豆新品种，还存在很多局限。随着对基因工程持续深入的研究，用转基因技术来改良品种已在许多作物上得到应用[1]。通过转基因技术同时配合传统育种方法，来进行提高大豆的产量和品质已经成为一种新的有效途径。在美国转基因大豆充斥中国市场的情况下，培育高产优质的自主大豆品种，已成为我国大豆育种的迫切任务，也是发展可持续农业的重要课题。
大豆是油料作物中最重要的豆科作物之一，研究发现在调控大豆的油脂含量中Dof蛋白也是发挥了重要的作用。Dof(DNA binding with one finger)蛋白是一类转录因子，并且是植物所特有的，目前还没有在果蝇、美丽线虫和酿酒酵母的基因组中发现存在Dof基因[2]。而Dof蛋白中有一个特别的富含Cys残基的单锌指保守结构域[3]，命名为Dof结构域。迄今为止，已在多种单子叶植物及双子叶植物中发现了Dof蛋白的存在[414]。Dof蛋白都仅仅含有一个拷贝的Dof保守域，通常情况下，是有2个主要的结构域来构成的，分别是位于N=末端的DNA结合高度保守结合域以及位于C=末端的转录调控域[15]。同时，因为转录调控结构域位于Dof蛋白C=末端, 而且其氨基酸序列是较为多变的，并不具有保守性, 这也导致了在植物中Dof蛋白的功能多样性[16]。而对Dof家族成员进行系统分类的依据，则是拟南芥的全基因组序列预测的Dof基因[17]，以及来自玉米、大麦、小麦、烟草和水稻等的部分Dof成员进行的[18]，而且从进化树[16]分析的结果我们可以发现，把这些Dof成员进行分类，能够分成7个不同的亚群，而且除了Dof保守域作为分类依据，存在于亚群中的其他的保守氨基酸，也可以为Dof家族成员的系统分类提供了辅助的分类信息[19]。
很多在体内外结合实验都可以说明，当Dof蛋白中的Dof结构域在与不同的植物基因启动子的DNA相结合时，具有特异性。同时，Dof蛋白与其他的锌指蛋白一样，它也是一个有双功能的结构域，即还具有蛋白蛋白互作的功能。因为Dof蛋白结合元件在很多种植物的特异性的启动子中都被发现了，而且由于Dof蛋白还具有蛋白蛋白互作的功能, 所以众多的研究证明：在植物生长和发育的过程中，Dof转录因子还参与多种生物学过程，比如碳氮代谢、光响应、花和花粉发育、种子发育和萌发、次生代谢、保卫细胞特异基因的调控、维管发育和叶片极性等[2027]。
植物中存在一些调控种子发育和种子储藏成分相关的基因，通过在大豆中表达或过表达这类基因，有希望获得产量和油分、蛋白等有效成分更高的大豆新材料，以满足育种和市场的需求。本实验通过将GmDof11基因转入大豆，对遗传转化中的抗性苗进行分子鉴定从而获得阳性植株，并对鉴定得到的阳性苗进行初步的生物学观测和生理指标测定，期望得到产量、品质有所改良的大豆新材料。
1材料与方法
1．1 材料
通过农杆菌介导大豆子叶节转化的方法得到转GmDof11基因大豆材料T0代。T2代2015年6月种于江浦网室，V3期以后取叶片用于提取DNA和RNA进行检测。
1．2 方法
1．2．1 DNA提取
用新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根）提取叶片DNA，具体的操作如下：
（1）取100mg转GmDof11基因T1代大豆植株V3期以后的叶片，把它放进洁净的研钵里，加入液氮后将叶片其进行充分的研磨，使其变成粉末状，再转移到离心管中，加入500μl缓冲液LP1和6μl RNaseA，涡旋振荡1min，室温静置10min；
（2）加入缓冲液LP2到离心管里，盖上管盖，上下摇荡使其得以充分混匀，涡旋1min；
（3）把涡旋后的离心管取出，再把其放入离心机中，以12000rpm离心5min，吸取上清，然后转入新的离心管里；
（4）加入1.5倍体积的缓冲液LP3（这里要确定加入了乙醇），立即上下振荡使其得以混匀15sec，注意此时可能会出现絮状沉淀；
（5）把（4）中得到的溶液以及絮状沉淀，全部加入到吸附柱CB3中去，并把其放进相互配套的收集管中，再以12000rpm离心30sec，弃废液；
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