二化螟中肠钙粘蛋白基因在sf9细胞中的表达
摘要：昆虫中肠上皮细胞中的钙粘蛋白作为Bt毒素Cry1A的功能受体已在多个鳞翅目昆虫中得到证实，并且钙粘蛋白突变能够引起昆虫对Bt毒素产生抗性。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统在Sf9细胞系中表达出二化螟Chilo suppressalis中肠钙粘蛋白，并对Bt毒素与钙粘蛋白的实时互作进行了研究。免疫荧光定位分析表明二化螟钙粘蛋白都能够在Sf9细胞膜上表达并能与Cry1Ac结合。细胞毒力测定结果显示，与100nM Cry1Ac毒素孵育后，感染CSCAD重组病毒的Sf9细胞死亡率达到7.9±0.8%，,感染pFastBac HTA空载体重组病毒的Sf9细胞死亡率达到7.3±0.6%，二者之间无显著差异（图4）。与500nM Cry1Ac毒素孵育后，感染CSCAD重组病毒的Sf9细胞死亡率达到8.1±0.4%。不同浓度处理后，感染同种病毒的Sf9细胞死亡率没有显著差异。研究显示二化螟中肠钙粘蛋白可能不是Bt毒素Cry1Ac的功能受体。本课题研究结果对于明确Bt毒素毒杀二化螟的分子机理具有重要理论意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1. 材料与方法2
1.1供试昆虫2
1.2主要试剂和仪器2
1.3重组杆状病毒的制备及其对昆虫细胞的感染2
1.3.1昆虫细胞的培养2
1.3.2 制备P1病毒液3
1.3.3 制备P2病毒液3
1.3.4 P3病毒液制备与鉴定3
1.3.5重组病毒对昆虫细胞的感染3
1.4免疫荧光定位分析3
1.5细胞毒力测定4
1.6数据分析4
2. 结果与分析4
2.1基因扩增及载体构建4
2.2钙粘蛋白基因在Sf9细胞中的表达5
2.3 Cry1Ac结合分析7
2.4 Cry1Ac毒素对Sf9细胞的毒力分析7
3. 讨论7
致谢8
参考文献 8
二化螟中肠钙粘蛋白基因在Sf9细胞中的表达
引言
二化螟(Ch
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
ilo. suppressalis (Walker))隶属于鳞翅目(Lepidoptera)、螟蛾科（Pyralidae）、草螟亚科（Crambidae)、禾草螟属（Chlio Zincken），是一种世界性重要农业害虫（卢代华等，2004）。二化螟是水稻等禾本科作物钻蛀性害虫，有食性杂、越冬场所多、转株危害等特点。在我国，二化螟分布广泛，北至黑龙江南到海南岛均有分布，尤其在丘陵山区分布更多，其中长江流域和江浙沿海为二化螟主要发生区，危害较为严重。近年来由于水稻栽培制度变更和全球气候变暖等因素的影响，水稻鳞翅目害虫的发生频率及危害程度呈加剧趋势（李东虎等，2004）。另外，长期不合理的用药导致水稻螟虫对多种化学杀虫剂产生了抗药性，引起防效降低，防治成本增加。
转基因技术的发展为水稻螟虫的防治提供了新策略。自上世纪80年代中期以来，国内外研究人员通过不同的转基因技术先后培育了多个高抗鳞翅目害虫的转基因抗虫水稻品种，其中一些品种已通过中间试验、环境释放以及生产性试验(Han et al., 2006)，而且伊朗于2005年已经批准了转Bt基因抗虫水稻的商业化种植。我国转基因抗虫水稻的研发一直位于世界领先水平，其中两种转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻：“华恢1号”和“Bt汕优63”于2014年12月11日再次获得由农业部颁发的农业转基因生物安全证书（生产应用），转基因水稻或可能商业化（http://news.163.com/15/0105/17/AF7AOM5100014SEH.html）。然而，转Bt水稻带来巨大经济效益的同时，还有一些问题尚未解决，如大规模种植转Bt水稻后，可能加速二化螟对转Bt水稻的抗性演化，导致杀虫剂的再次大量使用。目前已在多个鳞翅目害虫田间种群中检测到Bt抗性。1985年McGaughey(1985)首次报道了印度谷螟Plodia interpunctella对Bt制剂产生了抗性；Tabashnik等(1990)在田间发现小菜蛾Plutella xylostella对Bt制剂产生了抗性；Gunning等(2001)在澳洲新南威尔士和昆士兰州田间抗性监测中发现棉铃虫H.armigera也能够在Cry1Ac毒素的选择下存活下来；Janmaat等(2004)报道粉纹夜蛾Trichoplusia ni在温室对Bt制剂产生抗性。因此，开展靶标害虫对转基因水稻的抗性风险评价和抗性治理已成为当前亟需解决的问题。
近几年Bt cry 毒素在昆虫体内的作用方式有过不少报道，其中包括cry毒素溶解、蛋白质水解作用、受体结合、膜的嵌入和毛孔的结构等过程已经得到广泛认同，但是Bt cry毒素作用方式的很多细节还不是很明确，需要进行更加广泛深入的研究。昆虫会因为中毒过程中的任何一步的变化而产生抗性，多种蛋白已经被鉴定为Cry毒素的受体或假定受体。包括钙黏蛋白、氨肽酶N、碱性磷酸酯酶和ATP结合转运蛋白等，其中两种模型都显示钙粘蛋白在Bt毒素发挥毒力作用中起着无可替代的作用，本研究拟利用Sf9细胞对二化螟钙粘蛋白基因进行体外表达，通过Bt毒素受体实时互作监测、细胞毒力测定和毒素与钙粘蛋白结合区的互作等研究，揭示二化螟钙粘蛋白在Bt毒素发挥作用中的作用。完善Bt毒素抗性机制的理论基础，为转基因作物的推广可能带来的害虫抗性危机及早提出防治措施提供指导。
1. 材料与方法
1.1 供试昆虫
二化螟
1.2 主要试剂和仪器
Cry1Ac原毒素由苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD73菌株制备；
Cry1Ac活化毒素：Cry1Ac原毒素与胰蛋白酶（Sigma，T8642）按照20: 1比例温浴制备；
主要试剂：
SV总RNA提取试剂盒、MMLV反转录酶、Wizard? DNA纯化试剂盒和pGEMT载体均为Promega公司产品；
PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶和rTaq酶购自TakaRa公司。
限制性内切酶和FT4连接酶为Fermentas Life Sciences公司产品；
无内毒素质粒提取试剂盒为OMEGA公司产品；
BactoBac?Baculoviras Expression Systems、Sf900TMII昆虫细胞培养基和Cellfectin II为Invitrogen公司产品。
其它常规化学试剂为AR级产品。
1.3重组杆状病毒的制备及其对昆虫细胞的感染
1.3.1昆虫细胞的培养
本试验所用昆虫细胞为Sf9细胞，培养方式为28°C贴壁、避光培养，培养基为SF900II液体培养基（Invitrogen），平均35天传代一次。
1.3.2 制备P1病毒液
(1) 转染当天对Sf9细胞进行计数：细胞密度为1.6×106个/ml，细胞活力>90%，可用于转染；
(2) 6孔板每孔中加入89×105个细胞（通常每孔加2ml的细胞悬液），一般做两个平行样。28°C下细胞贴壁至少30min；
准备转染复合物：
①100ul的SF900II SFM中加入2ug的bacmid，轻轻吹打混匀；
②混匀Cellfectin II(Invitrogen)，将8ul Cellfectin II 加入到100ul的SF900 II SFM，轻柔的混匀；
③将①中稀释的质粒与②中稀释的Cellfectin II混合，室温下静置30min；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1. 材料与方法2
1.1供试昆虫2
1.2主要试剂和仪器2
1.3重组杆状病毒的制备及其对昆虫细胞的感染2
1.3.1昆虫细胞的培养2
1.3.2 制备P1病毒液3
1.3.3 制备P2病毒液3
1.3.4 P3病毒液制备与鉴定3
1.3.5重组病毒对昆虫细胞的感染3
1.4免疫荧光定位分析3
1.5细胞毒力测定4
1.6数据分析4
2. 结果与分析4
2.1基因扩增及载体构建4
2.2钙粘蛋白基因在Sf9细胞中的表达5
2.3 Cry1Ac结合分析7
2.4 Cry1Ac毒素对Sf9细胞的毒力分析7
3. 讨论7
致谢8
参考文献 8
二化螟中肠钙粘蛋白基因在Sf9细胞中的表达
引言
二化螟(Ch
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
ilo. suppressalis (Walker))隶属于鳞翅目(Lepidoptera)、螟蛾科（Pyralidae）、草螟亚科（Crambidae)、禾草螟属（Chlio Zincken），是一种世界性重要农业害虫（卢代华等，2004）。二化螟是水稻等禾本科作物钻蛀性害虫，有食性杂、越冬场所多、转株危害等特点。在我国，二化螟分布广泛，北至黑龙江南到海南岛均有分布，尤其在丘陵山区分布更多，其中长江流域和江浙沿海为二化螟主要发生区，危害较为严重。近年来由于水稻栽培制度变更和全球气候变暖等因素的影响，水稻鳞翅目害虫的发生频率及危害程度呈加剧趋势（李东虎等，2004）。另外，长期不合理的用药导致水稻螟虫对多种化学杀虫剂产生了抗药性，引起防效降低，防治成本增加。
转基因技术的发展为水稻螟虫的防治提供了新策略。自上世纪80年代中期以来，国内外研究人员通过不同的转基因技术先后培育了多个高抗鳞翅目害虫的转基因抗虫水稻品种，其中一些品种已通过中间试验、环境释放以及生产性试验(Han et al., 2006)，而且伊朗于2005年已经批准了转Bt基因抗虫水稻的商业化种植。我国转基因抗虫水稻的研发一直位于世界领先水平，其中两种转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻：“华恢1号”和“Bt汕优63”于2014年12月11日再次获得由农业部颁发的农业转基因生物安全证书（生产应用），转基因水稻或可能商业化（http://news.163.com/15/0105/17/AF7AOM5100014SEH.html）。然而，转Bt水稻带来巨大经济效益的同时，还有一些问题尚未解决，如大规模种植转Bt水稻后，可能加速二化螟对转Bt水稻的抗性演化，导致杀虫剂的再次大量使用。目前已在多个鳞翅目害虫田间种群中检测到Bt抗性。1985年McGaughey(1985)首次报道了印度谷螟Plodia interpunctella对Bt制剂产生了抗性；Tabashnik等(1990)在田间发现小菜蛾Plutella xylostella对Bt制剂产生了抗性；Gunning等(2001)在澳洲新南威尔士和昆士兰州田间抗性监测中发现棉铃虫H.armigera也能够在Cry1Ac毒素的选择下存活下来；Janmaat等(2004)报道粉纹夜蛾Trichoplusia ni在温室对Bt制剂产生抗性。因此，开展靶标害虫对转基因水稻的抗性风险评价和抗性治理已成为当前亟需解决的问题。
近几年Bt cry 毒素在昆虫体内的作用方式有过不少报道，其中包括cry毒素溶解、蛋白质水解作用、受体结合、膜的嵌入和毛孔的结构等过程已经得到广泛认同，但是Bt cry毒素作用方式的很多细节还不是很明确，需要进行更加广泛深入的研究。昆虫会因为中毒过程中的任何一步的变化而产生抗性，多种蛋白已经被鉴定为Cry毒素的受体或假定受体。包括钙黏蛋白、氨肽酶N、碱性磷酸酯酶和ATP结合转运蛋白等，其中两种模型都显示钙粘蛋白在Bt毒素发挥毒力作用中起着无可替代的作用，本研究拟利用Sf9细胞对二化螟钙粘蛋白基因进行体外表达，通过Bt毒素受体实时互作监测、细胞毒力测定和毒素与钙粘蛋白结合区的互作等研究，揭示二化螟钙粘蛋白在Bt毒素发挥作用中的作用。完善Bt毒素抗性机制的理论基础，为转基因作物的推广可能带来的害虫抗性危机及早提出防治措施提供指导。
1. 材料与方法
1.1 供试昆虫
二化螟
1.2 主要试剂和仪器
Cry1Ac原毒素由苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD73菌株制备；
Cry1Ac活化毒素：Cry1Ac原毒素与胰蛋白酶（Sigma，T8642）按照20: 1比例温浴制备；
主要试剂：
SV总RNA提取试剂盒、MMLV反转录酶、Wizard? DNA纯化试剂盒和pGEMT载体均为Promega公司产品；
PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶和rTaq酶购自TakaRa公司。
限制性内切酶和FT4连接酶为Fermentas Life Sciences公司产品；
无内毒素质粒提取试剂盒为OMEGA公司产品；
BactoBac?Baculoviras Expression Systems、Sf900TMII昆虫细胞培养基和Cellfectin II为Invitrogen公司产品。
其它常规化学试剂为AR级产品。
1.3重组杆状病毒的制备及其对昆虫细胞的感染
1.3.1昆虫细胞的培养
本试验所用昆虫细胞为Sf9细胞，培养方式为28°C贴壁、避光培养，培养基为SF900II液体培养基（Invitrogen），平均35天传代一次。
1.3.2 制备P1病毒液
(1) 转染当天对Sf9细胞进行计数：细胞密度为1.6×106个/ml，细胞活力>90%，可用于转染；
(2) 6孔板每孔中加入89×105个细胞（通常每孔加2ml的细胞悬液），一般做两个平行样。28°C下细胞贴壁至少30min；
准备转染复合物：
①100ul的SF900II SFM中加入2ug的bacmid，轻轻吹打混匀；
②混匀Cellfectin II(Invitrogen)，将8ul Cellfectin II 加入到100ul的SF900 II SFM，轻柔的混匀；
③将①中稀释的质粒与②中稀释的Cellfectin II混合，室温下静置30min；
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