利用crispr技术敲除蒺藜苜蓿ric8基因的初步研究
蒺藜苜蓿作为豆科的模式植物，是探究根瘤菌和豆科植物之间信号调节机制的理想材料。根毛的变形对于结瘤因子介导的根瘤菌侵染植物的过程非常重要。RIC家族是植物特有的一类小G蛋白ROP的下游效应子，参与ROP信号途径对细胞的极性生长的调控。蒺藜苜蓿ROP10被报道通过调控结瘤因子诱导的根毛变形参与根瘤菌侵染过程。本研究使用CRISPR技术构建蒺藜苜蓿RIC家族的成员之一RIC8的基因敲除载体，并导入蒺藜苜蓿中，为研究其在结瘤因子诱导的根毛变形过程中的功能奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1 引言2
1.1 蒺藜苜蓿遗传转化的研究进展 2
1.2 根毛参与豆科植物与根瘤菌的共生固氮过程2
1.2.1 根毛的生长模式2
1.2.2 根毛的变形过程3
1.3 结瘤因子3
1.4 ROPs和RICs的功能介绍3
1.5 CRISPR/Cas系统的功能介绍4
1.6 本论文研究目的和意义4
2 材料与方法5
2.1 实验材料5
2.1.1 植物材料5
2.1.2 菌株和质粒载体5
2.1.3 仪器设备5
2.2 试剂配制6
2.2.1 常用试剂和溶液的配制6
2.2.2 常用培养基的配置6
2.3 实验方法7
2.3.1 构建CRISPR/Cas9RIC8打靶载体7
2.3.2 蒺藜苜蓿转化（农杆菌介导法）9
2.3.3 CTAB法提取蒺藜苜蓿DNA9
3 结果与分析10
3.1 构建CRISPR/Cas9RIC8打靶载体10
3.2 CRISPR/Cas9RIC8蒺藜苜蓿植株的获得10
3.2.1 共培养10
3.2.2 培养愈伤组织11
3.2.3 胚的形成12
3.2.4 生根12
3.2.5 温室培养13
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
/> 3.3 对转基因蒺藜苜蓿的分子检测13
4 讨论与展望13
4.1 CRISPR/Cas9技术的应用意义13
4.2 蒺藜苜蓿遗传转化的研究意义14
致谢14
参考文献15
利用CRISPR技术敲除蒺藜苜蓿RIC8基因的初步研究
引言
1 引言
1．1 蒺藜苜蓿遗传转化的研究进展
蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是豆科苜蓿属的一年生植物，也被称为截形苜蓿或截叶苜蓿。蒺藜苜蓿的优势体现在：生长周期短，只需要80至100天就可以成熟；染色体组小，2n=16便于观察；基因组小，便于分析和修饰；遗传转化效率高，降低实验难度；自花授粉，不需要担心配种问题；共生固氮等[1]。蒺藜苜蓿与紫花苜蓿等豆科植物有亲缘关系，基因组间具有一定程度上的同源性，所以借助蒺藜苜蓿的实验成果及其基因资源对促进以紫花苜蓿为代表的其它豆科作物的遗传修饰和改造显得十分重要。
根癌农杆菌是普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，它可以趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，从而引起植物的根瘤病害。到目前为止，利用农杆菌侵染并通过组织培养方法的蒺藜苜蓿遗传转化工作有五种生态型的成功案例，它们分别是蒺藜苜蓿 R108、蒺藜苜蓿Jemalong 2HA、蒺藜苜蓿Jemalong J5、蒺藜苜蓿Jemalong A17和蒺藜苜蓿Jemalong M910a。因为蒺藜苜蓿生态型Jemalong A17具备优秀再生力，所以它是五个生态型中首先被用于研究蒺藜苜蓿与根瘤菌共生关系的模式植物。但是利用组织培养的方法对Jemalong A17蒺藜苜蓿进行遗传转化研究难度较大，因为Jemalong A17蒺藜苜蓿基因组序列是由单种子发育成的后代测序才得到的。相反的，蒺藜苜蓿R108生态型因为具有基因组小、种子产量大和种子成熟时间短等特点，所以常被用于研究相关的分子遗传过程。以蒺藜苜蓿生态型Jemalong和R108作为研究对象，可对豆科植物与根瘤菌共生互作的分子遗传机理进行深入研究。蒺藜苜蓿外植体的选择是遗传转化成功与否的关键。到目前为止，常用的外植体有叶片、子叶、花、根等。
1．2 根毛参与豆科植物与根瘤菌的共生固氮过程
1．2．1 根毛的生长模式
根毛是根的表皮细胞向外突起形成的管状结构，是吸收水分和营养物质的关键部位。根毛这种长管状结构使植物根部与土壤有更大的接触面积，大大促进了植物对土壤中养分和水的吸收利用效率。根毛具备培养周期较短，便于细胞学观察等优点，同时又与根瘤菌存在互作关系，而成为优良的研究系统[2]。
根毛的发育可以分成四个阶段：第一阶段是表皮细胞特异化突起位点的选择；第二阶段是根毛发生和突起的形成；第三阶段是顶端生长；第四阶段是根毛的成熟。
根毛的极性生长分为两个过程：根毛的发生和延伸。根毛发生过程是根表皮细胞产生生长点并凸起的过程，起始位置相对固定。拟南芥的根毛的发生部位在生根细胞的下部，靠近根尖的方向。对根毛的发生机理进行研究发现根毛的发生受到一系列因素的调控，包括植物体内的调控因子以及各种环境信号因子。在根毛的发生过程中，与极性相关的蛋白会富集在起始部位，例如小G蛋白ROP、与囊泡运输过程相关的调控蛋白、与细胞壁松弛过程相关的酶类等。
根毛的快速生长过程也由一系列的细胞活动协调完成，包括根毛起始涉及到的囊泡运输、Ca2+浓度梯度变化、细胞骨架的动态变化、小G蛋白ROP定位的改变等。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1 引言2
1.1 蒺藜苜蓿遗传转化的研究进展 2
1.2 根毛参与豆科植物与根瘤菌的共生固氮过程2
1.2.1 根毛的生长模式2
1.2.2 根毛的变形过程3
1.3 结瘤因子3
1.4 ROPs和RICs的功能介绍3
1.5 CRISPR/Cas系统的功能介绍4
1.6 本论文研究目的和意义4
2 材料与方法5
2.1 实验材料5
2.1.1 植物材料5
2.1.2 菌株和质粒载体5
2.1.3 仪器设备5
2.2 试剂配制6
2.2.1 常用试剂和溶液的配制6
2.2.2 常用培养基的配置6
2.3 实验方法7
2.3.1 构建CRISPR/Cas9RIC8打靶载体7
2.3.2 蒺藜苜蓿转化（农杆菌介导法）9
2.3.3 CTAB法提取蒺藜苜蓿DNA9
3 结果与分析10
3.1 构建CRISPR/Cas9RIC8打靶载体10
3.2 CRISPR/Cas9RIC8蒺藜苜蓿植株的获得10
3.2.1 共培养10
3.2.2 培养愈伤组织11
3.2.3 胚的形成12
3.2.4 生根12
3.2.5 温室培养13
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
/> 3.3 对转基因蒺藜苜蓿的分子检测13
4 讨论与展望13
4.1 CRISPR/Cas9技术的应用意义13
4.2 蒺藜苜蓿遗传转化的研究意义14
致谢14
参考文献15
利用CRISPR技术敲除蒺藜苜蓿RIC8基因的初步研究
引言
1 引言
1．1 蒺藜苜蓿遗传转化的研究进展
蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是豆科苜蓿属的一年生植物，也被称为截形苜蓿或截叶苜蓿。蒺藜苜蓿的优势体现在：生长周期短，只需要80至100天就可以成熟；染色体组小，2n=16便于观察；基因组小，便于分析和修饰；遗传转化效率高，降低实验难度；自花授粉，不需要担心配种问题；共生固氮等[1]。蒺藜苜蓿与紫花苜蓿等豆科植物有亲缘关系，基因组间具有一定程度上的同源性，所以借助蒺藜苜蓿的实验成果及其基因资源对促进以紫花苜蓿为代表的其它豆科作物的遗传修饰和改造显得十分重要。
根癌农杆菌是普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，它可以趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，从而引起植物的根瘤病害。到目前为止，利用农杆菌侵染并通过组织培养方法的蒺藜苜蓿遗传转化工作有五种生态型的成功案例，它们分别是蒺藜苜蓿 R108、蒺藜苜蓿Jemalong 2HA、蒺藜苜蓿Jemalong J5、蒺藜苜蓿Jemalong A17和蒺藜苜蓿Jemalong M910a。因为蒺藜苜蓿生态型Jemalong A17具备优秀再生力，所以它是五个生态型中首先被用于研究蒺藜苜蓿与根瘤菌共生关系的模式植物。但是利用组织培养的方法对Jemalong A17蒺藜苜蓿进行遗传转化研究难度较大，因为Jemalong A17蒺藜苜蓿基因组序列是由单种子发育成的后代测序才得到的。相反的，蒺藜苜蓿R108生态型因为具有基因组小、种子产量大和种子成熟时间短等特点，所以常被用于研究相关的分子遗传过程。以蒺藜苜蓿生态型Jemalong和R108作为研究对象，可对豆科植物与根瘤菌共生互作的分子遗传机理进行深入研究。蒺藜苜蓿外植体的选择是遗传转化成功与否的关键。到目前为止，常用的外植体有叶片、子叶、花、根等。
1．2 根毛参与豆科植物与根瘤菌的共生固氮过程
1．2．1 根毛的生长模式
根毛是根的表皮细胞向外突起形成的管状结构，是吸收水分和营养物质的关键部位。根毛这种长管状结构使植物根部与土壤有更大的接触面积，大大促进了植物对土壤中养分和水的吸收利用效率。根毛具备培养周期较短，便于细胞学观察等优点，同时又与根瘤菌存在互作关系，而成为优良的研究系统[2]。
根毛的发育可以分成四个阶段：第一阶段是表皮细胞特异化突起位点的选择；第二阶段是根毛发生和突起的形成；第三阶段是顶端生长；第四阶段是根毛的成熟。
根毛的极性生长分为两个过程：根毛的发生和延伸。根毛发生过程是根表皮细胞产生生长点并凸起的过程，起始位置相对固定。拟南芥的根毛的发生部位在生根细胞的下部，靠近根尖的方向。对根毛的发生机理进行研究发现根毛的发生受到一系列因素的调控，包括植物体内的调控因子以及各种环境信号因子。在根毛的发生过程中，与极性相关的蛋白会富集在起始部位，例如小G蛋白ROP、与囊泡运输过程相关的调控蛋白、与细胞壁松弛过程相关的酶类等。
根毛的快速生长过程也由一系列的细胞活动协调完成，包括根毛起始涉及到的囊泡运输、Ca2+浓度梯度变化、细胞骨架的动态变化、小G蛋白ROP定位的改变等。
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